复旦基因组学课件03物理图绘制

第3章物理图绘制什么是基因组物理图?Physicalmap:采用非遗传重组的方法以DNA碱基顺序为图距单位绘制的位于染色体上基因线性排列次序的图譜.Amapofthelinearorderofgenesonachromosomewithunitsindicatingtheirdistancesdeterminedbymethodsotherthangeneticrecombination.见：维基百科物理图的类别1)限制性酶切位点物理图2)克隆叠连群物理图3)染色体荧光标记原位杂交物理图4)STS分子标记物理图物理图的作图方法1）限制性作图（Restrictionmapping）它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。2）依靠克隆的基因组作图(Clone-basedmapping)根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建叠连群(Contig)绘制物理连锁图。3）荧光标记原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。4）顺序标签位点（Sequencetaggedsite,STS）作图通过PCR或分子杂交将小段单拷贝DNA顺序定位在染色体区段中。限制性作图---（Restrictionmapping）1)通过实验将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.2)根据DNA顺序计算机标示电子酶切位点物理图.限制性作图—小分子DNADNA分子电子酶切物理图16621cgatgtccatgaaggcgagtgcggagcctactccgcctcacgcaccttggttggcaaggc16681ctttcgtcagggtttctattggctgacggctcttaacgacgcggtcgacctggtccggcg16741gtgcagggcgtgccagttccacgccaggcaaacccatcagccggcccaggccctgcagac16801catacctctttcgtggccgtttgctgtctgggggctcgatatcctgggtccgttcaggcg16861ggccccgggcgggttcgagtatctgtatgtcgctgtcgacaagttcactaagtggcccga16921ggcttatccggtcatcaagatcgataagcactccgcgcttaaattcatcagaggcatcac注:红色标示的为水稻BAC克隆AP007224SalI酶切位点.如果DNA顺序是已知的,可以通过计算机软件搜寻DNA顺序中不同限制酶酶切位点绘制DNA分子限制性物理图.大分子DNA物理图绘制大分子DNA的研究策略与方法1)什么是大分子DNA:百万碱基对,Mb2)大分子DNA研究的面临的问题:易断裂,难分离,难克隆3)大分子DNA的研究方法:1.制备---琼脂糖包埋法2.酶切---稀有酶切位点限制酶3.分离---脉冲电泳分离4.克隆---载体设计稀有切点限制性内切酶的应用1)什么是稀有切点内切酶:在基因组DNA顺序中只有很少可识别序列的限制酶,一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比.2)选用稀有切点限制酶注意事项:a)识别位点的非特异顺序,-GANTC-(HinfI),-GCCNNNNNGCC-(BglI)b)高等生物基因组一般A/T比较高,应选G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因组甲基化状态,高等生物基因组DNA甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化稀有切点限制酶限制性核酸内切酶的命名规则1)限制性核酸内切酶主要是从原核生物中提取的。通用的命名规则是：第一个字母是细菌属名的首字母，斜体大写.第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，斜体小写.接下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。2)例子:大分子DNA的分离技术脉冲交变电场电泳均一脉冲电场电泳采用大分子DNA技术绘制E.coli基因组物理图大肠杆菌基因组物理图绘制大肠杆菌基因组遗传图大肠杆菌基因组遗传图与物理图整合克隆作图---大分子DNA的克隆根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建叠连群(Contig),绘制物理连锁图。大分子DNA克隆载体1)大分子DNA克隆载体:YAC,BAC,PAC,HAC,MAC,TAC优缺点:2)大分子DNA克隆的作图:步移法指纹法酵母人工染色YACYAC载体与Olson细菌人工染色体BAC噬菌体人工染色体PACYAC和BAC基因组文库的构建1)目标基因组大分子DNA的制备2)载体制备3)载体和插入DNA的连接4)转化5)转化子鉴定目标基因组大分子DNA的制备1)动物细胞:样品洗涤→低溶点琼脂糖包埋→蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解2)植物细胞:样品(叶片)→洗涤吸干水分→液氮冷冻→碾碎→离心收集细胞核→低融点琼脂糖包埋→蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解部分酶解制备大分子DNA片段1)低融点琼脂糖包埋:薄片法,微粒法2)酶解:3)选择限制酶,缓冲液,酶浓度,酶解时间4)加入0.5EDTA溶液终止酶解琼脂糖包埋法1)分离纯化细胞核2)将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中3)蛋白酶消化处理细胞核酶切大分子DNA的分离载体制备与插入DNA连接1)YAC载体制备过程与一般质粒载体相同2)BAC载体低拷贝载体,大量制备,超离心纯化3)酶切释放接头,接头去磷,减少自连4)连接(方法1)将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合,按重量比1:1.680C保温5min,降温至370C,加入连接酶过夜.5)连接(方法2)将含有大分子DNA的琼脂糖薄片680C保温5min,降温至370C,加入agarase消化.然后取出部分DNA样品,按重量比1:1加入载体,加入连接酶过夜.除去未连接载体YAC转化1)酵母原质体的制备采用蜗牛酶(lyticase)处理酵母细胞脱壁,酵母原质体保温在渗透压缓冲液中.2)转化酵母原质体加入YAC连接载体,200C保温过夜.3)筛选培养基酵母基本培养基,缺少URA,色氨酸和腺苷酸.4)铺板将转化处理的酵母原质体悬浮在渗透压选择液化培养基中迅速铺板.5)300C培养4-5天,出现白色克隆为阳性克隆.YAC克隆检测---大分子DNASouthern杂交YAC克隆的优缺点1)优点:容量大,插入片段可达1000kb.2)缺点:转化效率低.嵌合克隆比例高,达48%.克隆DNA的制备困难.3）上世纪90代初该克隆体系被放弃。BAC克隆—主流大分子DNA克隆技术1)载体与插入大分子DAN的连接:将含有大分子DNA的琼脂糖薄片680C保温5min,降温至370C,加入agarase消化.然后取出部分DNA样品,按重量比1:1加入载体,加入连接酶过夜2)宿主菌制备:选定的宿主菌在完全培养基上培养至光密度0.2,收集细菌.3)将细菌密度调整到109,加入连接反应液,转移到电击杯(0.1cm直径)中.电击转化参数:25000V/cm.4)氯霉素选择培养基上筛选阳性克隆,阳性克隆白色.叠连群构建将彼此顺序重叠的大分子DNA克隆依次排列组建叠连群,绘制由大分子DNA克隆组成的物理图,方法如下:1)染色体步移法(chromosomalworking)2)指纹重叠法染色体步移指纹作图—3种指纹限制性片段指纹作图原理指纹作图的目的有二:1)对大分子DNA克隆进行排序.2)选择最适合测序的DNA克隆.限制性片段指纹电泳图指纹重叠群构建酵母基因组遗传图与物理图的整合顺序标签位点作图（Sequencetaggedsite,STSmapping）通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中。STS作图原理辐射杂种作图辐射杂种图距单位DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率,其图距单位为厘镭(centiRay,cR).辐射杂种连锁分析人类21号染色体辐射杂种图一段人类染色体DNA的辐射杂种图人类基因组辐射杂种图距染色体物理长度（Mb）cM/cRkb/cR平均滯留率（范围）————————————————————————————————12630.2019721.1(14.3-50.6)22550.2122523.8(14.3-37.5)32140.2723326.9(14.3-41.1)42030.2825624.3(11.3-44.0)51940.2927226.9(17.3-49.4)61830.2424330.6(21.4-49.4)71710.2322927.7(19.0-44.6)81550.2627131.0(31.0-45.8)91450.3830522.1(14.3-27.4)101440.2625328.5(16.2-56.3)111440.3027025.7(20.2-38.7)121430.2123432.1(23.2-50.6)13q980.2217922.9(16.7-36.3)14q930.3420832.0(21.1-57.1)15q890.3620331.7(24.4-45.2)16980.4320130.5(21.6-39.9)17920.2314761.6(33.9-93.5)18850.3017234.3(20.7-43.5)19670.2011032.2(21.4-45.8)20720.3019131.0(16.1-41.1)21q390.3115150.1(39.3-71.3)22q430.9518536.6(30.4-50.6)X1640.3123118.4(11.9-30.4)基因组31540.2820829.2(11.3-93.5)遗传图物理图和细胞图的整合物理图的应用---图位克隆或定位克隆map-basedcloningorpositionalcloning图位克隆的步骤1)连锁分子标记的筛查与克隆—粗定位;2)将连锁分子标记向靶基因位置逼近—精细定位(finemapping);3)以紧密连锁分子标记为探针筛选基因组克隆;4)染色体步移,构建覆盖靶基因位点的叠连群;5)以覆盖靶基因位点的DNA克隆为探针从cDNA文库筛选候基因;6)候选基因多态性分析;7)转基因验证.图位克隆:靶基因连锁标记的分离番茄抗病基因的图位克隆思考题1)什么是基因组物理图?物理图与遗传图有何不同?2)如何制备与分离大分子DNA?3)何谓限制性作图?4)要获得大片段DNA需要采用哪类限制性内切酶?5)有哪些大分子DNA克隆载体?它们有何优缺点?6)什么是重叠群?如何构建重叠群?7)STS作图依据的原理是什么?8)叙述辐射杂种作图的过程.辐射杂种作图的图距单位是如何确定的.9)什么是DNA指纹?有哪些DNA指纹?10)什么是定位克隆?如何进行定位克隆?