复旦基因组学课件08-2小分子RNA--small RNA

小分子RNA--smallRNA什么是干扰小RNA?miRNA(微小RNA):MicroRNAs(miRNAs)即微小RNA是在所有真核类中发现的平均长度为22nt的小分子RNA.miRNAs产生于前体mRNA(pre-mRNA),可与靶mRNA配对并抑制mRNA的翻译或促使其降解,具有转录后调控基因表达的功能.人类基因组中约有1000种miRNA,可影响60%的基因的表达与调控.siRNA(小RNA):SmallinterferingRNA(siRNA),sometimesknownasshortinterferingRNAorsilencingRNA,isaclassofdouble-strandedRNAmolecules,20-25nucleotidesinlength,thatplayavarietyofrolesinbiology.Mostnotably,siRNAisinvolvedintheRNAinterference(RNAi)pathway,whereitinterfereswiththeexpressionofaspecificgene.See:干扰小RNA的种类有4大类干扰小RNA(smallinterferingRNA):1)miRNA,Micro-interferingRNA2)siRNA,Short-interferingRNA3)piRNA,Piwi-interactingRNA,仅限动物4)21URNA,线虫microRNAmicroRNA是如何发现的?殊途同归:1)植物转基因沉默2)真菌转基因沉默3)线虫RNA注射实验4)线虫发育突变研究4个独立的研究均发现RNA诱导内源基因沉默。植物转基因沉默1989年Matzke等为了加深矮牵牛花瓣的颜色将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞,并获得再生植株.未曾预料的是,在转基因阳性植株中出现完全为白色花瓣的植株.深入研究发现,导入矮牵牛的转基因含有反向尾--尾重复的结构.产生正义和反义基因转录产物.正义和反义基因转录产物形成dsRNA,导致转基因和内源基因的沉默,使原本产生紫色花色的花瓣变成白色.这是首次报道正反义双链RNA导致基因沉默.Posttranscriptionalgenesilencing(PTGS)inplants.Dr.MarjoriMatzkeDr.AntoniusMatzke真菌转基因诱导的内源基因沉默(PTGS)Isolationofquelling-defective(qde)mutantsimpairedinposttrans-criptionaltransgene-inducedgenesilencinginNeurosporacrassa,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997):Thesequelling-defectivemutants(qde)belongingtothreecomplementationgroupshaveprovidedinsightsintothemechanismofposttranscriptionalgenesilencinginN.crassa.Therecessivenatureoftheqdemutationsindicatesthattheencodedgeneproductsactintrans.Weshowthatwhenqdegenesaremutatedinatransgenic-inducedsilencedstraincontainingmanycopiesofthetransgene,theexpressionoftheendogenousgeneismaintaineddespitethepresenceoftransgenesenseRNA,themoleculeproposedtotriggerquelling.线虫双链RNA分子导致的基因沉默1995年Cornell大学的研究人员Guo和Kemphues在研究阻断秀丽新小杆线虫中的par-1基因时，利用反义RNA(antisenseRNA)技术特异性地阻断par-1基因的表达，同时在对照实验注射正义RNA（senseRNA）观察基因表达是否增强。但结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径,这与传统的反义RNA功能解释自相矛盾，作者对此未给出合理解释。1998年2月，Fire和Mello首次揭开谜底。他们证实，Guo等报道的正义RNA抑制基因表达的现象是由于实验中污染了微量双链RNA(DoubleRNA,dsRNA)所致。他们将体外转录的单链RNA纯化后注射线虫，发现基因抑制效果十分微弱。而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断靶基因的表达，其效率高于单链反义RNA约2个数量级。Fire等对dsRNA调控内源基因表达的现象创造了一个名词:RNAinterference,简称RNAi,即RNA干扰.See:FireA,(1998).Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391:806–11.2006年生理与医学诺贝尔奖Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNAMEX-3isaKHdomainproteinthatregulatesblastomere(卵裂球)identityinearlyC.elegansembryosa,Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.b,Embryofromuninjectedparent(showingnormalpatternofendogenousmex-3RNA20).c,Embryofromaparentinjectedwithpurifiedmex-3BantisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainthemex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.d,EmbryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3B;nomex-3RNAisdetected.Eachembryoisapproximately50mminlength.线虫发育突变与小分子RNA上世代70年代中期，悉尼Brenner实验室发现了lin-4突变体。1988年夏，Abros小组开始克隆lin-4基因。他们获得了一段700bp长的cDNA，但未发现ORF。将lin-4的700bp进行移码突变，结果也未能使其失去原有功能。这使他们认识到，lin-4可能是非编RNA。与此同时，另一个小组Ruvkun实验室也获得一个类似lin-4表型的突变，并采用定位技术将lin-14的突变确定在lin-14的3’末端。他们发现，lin-4和lin-14的3’末端有多处互补序列。由此他们认为，lin-4基因的适时表达可以使lin-14基因沉默，使线虫发育进入L2期。2000年，采用定位克隆技术发现另一个基因let-7.Let-7可以使lin-41基因沉默，使幼虫过早进入成虫期。这些小RNA当时被称为“smalltemporalRNA”(stRNA).自let-7非编码小RNA可调控基因表达后,non-codingRNA的生物学才引起广泛关注.2006年生理与医学诺贝尔奖瑞典皇家卡罗林医学院10月2日在瑞典首都斯德哥尔摩宣布，两名美国人——安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛——为2006年度诺贝尔生理学或医学奖的得主.他们发现了RNA干扰的机制而入选。RNA干扰是一个分子生物学过程，在这个过程中双链RNA（double-strandedRNA）以一种非常确定的方式抑制基因的表达。自1998年发现以来，RNA干扰已经作为一种有效的“基因沉默”(genesilencing)技术应用于许多分子生物学领域的研究。用以探讨基因的功能以及在基因治疗中可能的应用价值。RNAi在2005年被Science杂志选为当年科学领域十大进展之一.lin-4miRNA和let-7miRNA的功能LIN14蛋白控制幼虫L1期进入L2期,LIN41控制L4期,阻止lin-29表达进入成虫期.lin-4RNA干扰LIN14,let-7干扰LIN41.线虫Let-7突变剖析Let-7的突变互补实验,只有在涉及红色的DNA区段才可使表型恢复.let-7与靶基因mRNA的互作单个miRNA可识别多个mRNA靶标,一个mRNA靶标可被多个miRNA识别.let-7基因家族的成员不同物种let-7基因家族的成员：1）线虫,4个成员2)人类,15个成员3)果蝇，1个成员let-7基因家族成员在进化中有不同的扩张与收缩。lin-4miRNA和let-7miRNA干扰的靶mRMAmiRNA与靶mRNA之间有多种互作方式.见:Nature403:901-905,2000两种调控小分子RNA—miRNA和siRNA根据小分子RNA的来源及其加工方式,可将其分为两大类:1)miRNA(microRNA):微小RNA,主要来源于pre-mRNA.2)siRNA(shortinterferingRNA):小分子干扰RNA,主要来源于内源转座子,反向重复DNA,转基因表达产物,外源病毒等.到2005年，在12个物种中共报道了2953个miRNA:线虫,114;果蝇:78;斑马鱼(Daniorerio),369;鸡,122;拟南芥,117;人类,328;小鼠,224;大鼠,186.miRNA的加工及普遍结构动物miRNA基因的结构与分布动物miRNA基因属于PolII基因,加帽与加尾,有三种分布方式:1)独立结构2)内含子中(mirTron)3)外显子中4)3’UTR人类基因组约50%miRNA基因成簇状排列。1/4人类miRNA位于内含子中.人类多顺反子miRNA基因多呈簇集分布miRNA基因的数量MicroRNAgenesconstitute~1%ofthetotalcodinggenesandformthelargestclassofregulatorymolecules.See:LimLP,GlasnerME,YektaS,BurgeCB,BartelDP.VertebratemicroRNAgenes.Science.2003;299(5612):1540.动物miRNA的转录与加工成熟miRNA的3’末端有2nt的突出,形成miRNA:miRNA*的双链RNA(dsRNA)。pri-miRNA在细胞核内形成发夹结构，发夹环70nt。发夹两侧含有加工所需的顺序。双链结构可被细胞核蛋白DGCR8识别，DGCR8可与Drosha酶结合形成pri-miRNA加工复合体。Drosha含一个RNaseIII结构域，可在距发夹基部约11nt的位置将发夹切离并释放，产生pre-miRNA。Pre-miRNA的3’末端含2nt突出。pre-miRNA由细胞核进入细胞质涉及核质转运蛋白Exportin-5，Exportin-5可识别Pre-miRNA的3’末端突出2nt，并将其转运到细胞质。细胞质中RNaseIII酶Dicer与Pre-miRNA的3’端互作，将发夹环切离释放，产生长度为22nt配对不完善的双链RNA，即miRNA：miRNA*。miRNA：miRNA*双链中只有一条单链与RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）结合，随后与靶mRNA互作。miRNA*释放后被降解.miRNA诱导基因沉默1)成熟的miRNA与RNA-inducedsilen