复旦生物化学课件4-蛋白质化学2-一级结构及分析

蛋白质的一级结构及其分析PeptidesandProteins•氨基酸的多聚物，分子量大小差异极大，可以是2或3个到成千上万个氨基酸残基连接而成。•两个氨基酸残基之间通过共价的酰胺键（肽键）连接形成一个二肽；三个氨基酸残基连接成三肽；…；有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽；多个氨基酸残基则连接成多肽；蛋白质可以是成千上万个氨基酸残基连接而成。•多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以下的称为多肽。•肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下的半衰期为7年。肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键缩合水解氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基（residue），带有游离-氨基的一端被称为氨基（末）端（或N端），带有游离-羧基的一端被称为羧基（末）端（或C端）。H2N-S-G-Y-A-L-COOH肽链上的解离特性•氨基酸形成肽链后，整个肽链上留下N端可解离的氨基、羧基端可解离的羧基、侧链上能够解离的R基团，中间氨基酸的-氨基和-羧基由于形成肽键而不再对整个肽链的解离有贡献。•肽也有特征滴定曲线及特征pI。•R基团的解离常数由于氨基酸的氨基和羧基被用于形成肽键成为了残基，其解离在一定程度上会发生改变，这种变化受到-氨基及-羧基失去电荷、与其他R基团的作用、其他能够影响解离常数的环境因子有关。生物活性的肽及多肽的大小差异极大不能对生物活性肽及蛋白质的分子量与功能之间作出相关性结论。自然存在的肽的大小从2个到数千个氨基酸残基，甚至最小的肽也能表现出重要的生物学作用，如商业化合成的二肽L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯[人工甜味剂-阿斯巴甜(aspartame)或纽特健康糖（NutraSweet)，比蔗糖甜200倍]。1965年由科学家JamesSchlatter在研究蛋白质时发现，经16年100多次的科学研究及验证后，阿斯巴甜于1981年(FDA批准）以Nutrasweet（纽特健康糖）品牌正式推出市面。1986年我国卫生部批准可用于除罐头以外的所有食品中。COCH2CH2CHNH2COOHNHCHCH2SHCONHCH2COOHgamma-Glu-L-Cys-AlaGSH可被氧化成GSSGGSH作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在；维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。谷胱甘肽Glutathion(e)（GSH）(GSSG)H2N-Glu-Cys-Gly-COOH蛋白质中多肽链的长度差异极大肌联蛋白一些小肽在极低浓度下发挥作用•一些脊椎动物的激素是小肽，包括催产素（oxytocin）（9个氨基酸残基），由垂体后叶制造，能刺激子宫收缩；舒缓激肽（bradykinin）（9肽）能使呼吸道平滑肌收缩，抑制组织炎症；甲状腺激素释放因子（3肽），下丘脑分泌，能刺激垂体前叶促甲状腺素的释放，它们发挥作用的浓度极低。•与许多抗生素一样，一些极毒的毒蘑菇毒素，如鹅膏蕈碱（毒素）(双环的8肽毒素）(amanitin)，对动物有致死作用，与真核生物RNAII聚合酶作用抑制转录。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽Leu-脑啡肽牛催产素牛加压素NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构鹅膏蕈碱（鹅膏毒素、蝇蕈素）的化学结构蛋白质可以有不同的多肽亚基•一些蛋白质只含有一条简单的多肽链，而另一些蛋白质成为多亚基蛋白质，含有两条或更多条非共价结合的多肽链。多亚基蛋白质的独立的多肽链可以是同一多肽链，也可以是不同的多肽链。•有时，不同的亚基形成小的寡聚体(oligomeric)，并以此进一步装配。这种小的寡聚体被称为原体(protomers)，原体再装配成更大的聚集体。如血红蛋白，四条非共价结合的多肽链，两条一致的链和两条相同的链，可以称为四条多肽亚基的四聚体或者原体的二聚体；天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由6个调节亚基（R）和6个催化亚基（C）组成，装配时先由1个C亚基和1个R亚基组成一个原体CR，再由6个原体装配成一个有活性的酶。一些蛋白质的两条或多条多肽链是共价连接的胰岛素的两条多肽链通过二硫键共价连接，这种情况下，单条多肽链不是亚基，通常被简单地认为是肽链。因此一条多肽链及共价连接的多肽链不是四级结构。从蛋白质的大小估算氨基酸残基数•可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质的分子量除以110，即为组成氨基酸的数目。•20种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨基酸在蛋白质中出现的比例，平均分子量只有128，形成肽键时失去一分子水（18），因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量为128-18=110。多肽具有特征性的氨基酸组成，多肽或蛋白质以酸水解产生游离-氨基酸的混合物。当完全水解时，每一种类型的蛋白质产生一种特征性的氨基酸比例或混合物。20种氨基酸几乎从不以相同的比例出现在一个蛋白质中，有高有低，甚至有的只出现一次或根本不出现。有些蛋白质含有非氨基酸的化学基团很多蛋白质，如核糖核苷酸酶、胰凝乳蛋白酶，仅含有氨基酸残基，没有其他化学基团-单纯蛋白质。但有些蛋白质，除氨基酸残基外，还含有永久连接的化学组成，被称为复合蛋白质，非氨基酸连接的化学基团被称为辅基(prostheticgroup)。复合蛋白质的分类根据辅基的化学特性，如脂蛋白含有脂、糖蛋白含有糖、金属蛋白含有特异的金属。有些蛋白质甚至含有不止一种辅基，辅基通常对蛋白质的功能起重要作用。铁蛋白酪蛋白质体蓝素肽的物理化学性质•肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大，而肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小，侧链R基的差别不大。•等电点（两性）。•酸碱性质取决于：α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离•具有双缩脲(biuret)反应(H2N-CO-NH-CO-NH2)--Pr特有的反应（与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生紫红色或蓝紫色颜色反应，可用于肽和蛋白质定量测定）。1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:primarystructure一级结构：氨基酸序列secondarystructure二级结构：α螺旋，β折叠tertiarystructure三级结构：所有原子空间位置quarternarystructure四级结构：蛋白质多聚体1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构的实体）这两个层次。蛋白质的结构层次肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连肽键CONCN+O-CNCOHC•肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。•组成肽键的原子处于同一平面。•肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。•在大多数情况下，以反式结构存在。肽键平面6个原子处于同一肽键平面上一般C=N双键(0.128nm)肽键的C及N周围三个键角之和均为360°两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转两个肽键平面之间的α-碳原子，可以作为一个旋转点形成二面角(dihedralangle)。二面角的变化，决定着多肽主键在三维空间的排布方式，是形成不同蛋白质构象的基础。二面角(DihedralAngle)绕Cα-N键轴旋转的二面角（C-N-Cα-C）称为φ，绕Cα-C键轴旋转的二面角（N-Cα-C-N）称为ψ，原则上φ和ψ可以取-180°~+180°之间的任一值，这样多肽链主链的各种可能构象都可用φ和ψ这两个二面角或扭角来描述。•研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。•二十世纪四十年代起，许多人不遗余力地从事蛋白质的一级结构研究，Sanger第一个将一个蛋白质（胰岛素）的所有氨基酸的排列顺序通过高度的实验技巧加以确定。蛋白质一级结构的测定历史上第一个被确定氨基酸序列的肽（蛋白质）胰岛素Insulin,51AAs胰岛素的历史第一个生化药物•最小的蛋白质，由A链(21AA)和B链(30AA)组成；胰腺ß细胞分泌的一种激素，告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；•1921年Banting&Best从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，1923年Banting&Macleod获Nobel医学奖；•1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；•1981年，Berg（因DNA重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素。科学怪才FredrickSanger•FrederickSanger(1918-)isaBritishmolecularbiologistwhowasworkingonproblemsrelatedtothedeterminationofthestructureofproteins.Hisstudiesresultedinthedeterminationofthestructureofinsulinin1953;forthisdiscoveryhereceivedNobelPrizeinChemistryin1958.•In1965,hedevelopedthechainterminationmethod,alsoknownastheSangermethod.HelaterreceivedanotherNobelPrizeinChemistryin1980forcontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids.•In1992,theSangerCentreinCambridge,namedafterFrederickSanger,wasfoundedbytheWellcomeTrustandtheBritishMedicalResearchCouncil,thepurposeofwhichisstatedontheirwebsiteas“toprovideamajorfocusintheUKformappingandsequencingthehumangenome,andgenomesofotherorganisms.两获诺贝尔奖（仅4人），唯一两获诺贝尔化学奖。Sanger试剂(FDNB)标记N末端ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E12345结论：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解纸层析、薄层层析帮助确定氨基酸种类最终靠重叠法确定整个肽链－－－－－－－－－－－－－多肽↓→→→→→→→→→→→→→→→↓→→→→氨基酸序列历史上第一个被确定氨基酸序列的酶（1960年）核酸酶Ribonuclease,124AAsMoore&Stein氨基酸自动分析仪Edman降解法Sanger法1958年设计获1972年诺贝尔化学奖全自动氨基酸分析仪•氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的自动化分析系统，广泛用于制药、食品、饲料、农业、育种、医学研究、临床诊断和地质考察等领域。•原理：阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生、可见光光度法测定。蛋白质一级结构的经典分析方法1.样品必需纯（97%以上）；2.测定蛋白质的分子量；3.测定蛋白质由几个亚基组成；4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质一级结构的要求蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定(1)、肽链的拆开和分