复旦生物化学分子生物学部分课件--蛋白质代谢

蛋白质的生物合成-翻译ProteinBiosynthesis-Translation•特点-翻译过程十分复杂-参与因素多-合成步骤繁•20种氨基酸•mRNA和遗传密码•tRNA•核糖体•酶和辅助因子及无机离子、以ATP、GTP•合成方向：N→C端UTRUTRPartIDecodingoftheGeneticcodeProteinsaresynthesizedatroughER核糖体20世纪50年代PaulZamecnik通过将同位素标记的氨基酸注射到大鼠体内，按不同时间取肝脏分析同位素标记的氨基酸跑到哪里去了。时间长了会在任何地方都有同位素标记，但在注射后数分钟就检测，同位素全部跑到了含有RNA的小颗粒中（即核糖体，ribosome)。遗传密码的概念：mRNA上的核苷酸顺序与蛋白质中的氨基酸之间的对应关系称为遗传密码。mRNA上每三个连续核苷酸对应一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子，或三联体密码（tripletcodons）。三个不同的实验证明了遗传密码是mRNA上3个连续的核苷酸残基构成的，下面给出了三个证明遗传密码是三联体密码的著名实验的示意图。Nirenberg、Khorana因遗传密码的破译而与另一位科学家（霍利）分享了1968年诺贝尔生理学奖。遗传密码1957年Hoagland,M.B.发现，将氨基酸、ATP和肝细胞质放在一起，氨基酸会与热稳定的一类小分子RNA结合在一起，后来被证明这就是tRNA分子。同年,F.Crick在比较了核酸和氨基酸的大小和形状后，认为不可能在空间上互补，因此他对核酸→蛋白质的信息传递作了以下预测：1).它是一种分子转换器，使信息从核酸序列转换成氨基酸序列；2).这种分子很可能是核酸；3).它不论以何种方式进入蛋白质翻译系统的模板，都必须与模板形成氢键（即配对）；4).有20种分子转换器，每种氨基酸一个；5).每种氨基酸必定还有一个对应的酶，催化与特定的分子转换器结合。根据抽屉原则，Crick还预言一个氨基酸对应三个核苷酸。Crick预言的分子转换器(adaptor)DNArecombinationexperimentsthatprovedthegeneticcodonsastripletsMutationexperimenttells:Tripletsdonotoverlap,buttherearethreereadingframesPre-requirementforelucidationoftheGeneticcode•要有确定的已知序列的mRNA•要有同位素标记的氨基酸•1955年，MarianneGrunberg-Manago和SeveroOchoa从细菌中发现了一个酶，polynucleotidephosphorylase(PP),催化以下反应：(NMP)n+NDP(NMP)n+1+Pi这是第一个发现的核酸聚合酶，为模板非依赖性，在细菌中主要起降解RNA的作用,但可用来随机合成RNA多聚物。•第一个被确定的密码子是TTT，对应Phe.1961年，MarshallNirenberg用PP合成了poly(U),将它放入20根试管中，每根试管中加入了大肠杆菌细胞质抽提物和一种有同位素标记的氨基酸。反应一段时间后用TCA（三氯乙酸）将蛋白质沉淀下来，测定同位素的量，结果发现在加了同位素标记Phe的试管的沉淀物中同位素含量特别高。•很快，密码子CCC对应Pro,AAA对应Lys,但poly(G)没有得到结果（高级结构的缘故）。用统计法尝试确定含多种核苷酸的密码子的碱基组份1964年Nirenberg等发现将核苷酸三联体与对应的AA-tRNA放在一起，AA-tRNA就会结合到核糖体上去。核糖体结合实验:Thefinalsolution几乎同时，GobindKhorana成功地合成了非随机重复的多聚核苷酸。当这些多聚物得到的结果与Nirenberg的结果进行比较时，得到了确切的密码子信息。如(AC)n得到的结果是H和T等量参入，而密码的分布是等量的CAC和ACA,因此CAC对应H,ACA对应T.1965年由Crick绘制的密码表，UGA,UAA和UAG因为没有对应的氨基酸而导致肽链合成终止，因此定义为终止密码子(stopcodon),而从蛋白质的N末端测定的数据表明Met对应的是起始密码子。ThegeneticcodeThepresentgeneticcodeisuniversalinallorganismsontheearth唯独在线粒体、支原体等中有少量变化酿酒酵母光滑球酵母彭贝裂殖酵母丝状真菌锥虫莱茵衣藻密码子的简并(degeneracy)是预料之中的事。事实上所对应的密码子的多少与该氨基酸在生物中的利用度成比例。并不是一个tRNA对应一个密码子，一般只有三十几种tRNA来对应61个密码子，因此需有个机制让tRNA“偷懒”。这就是Crick的Wobble假说.密码的特点•连续性•兼并性在不同生物中使用同义密码子的频率是不相同的——偏爱密码•摆动配对（变偶现象）•通用性–线粒体的密码有一定的差别–AUG—起始密码和甲硫氨酸–UAG、UAA、UGA—终止密码硒半胱氨酸是大肠杆菌的第21个拥有密码子的氨基酸（识别UGA）高浓度时取代正常Cys，用在同步辐射实验中从蛋白质化学的角度看,遗传密码已经得到优化影响小影响大氨基酸的突变从其疏水指数的变化对蛋白质的构象的影响来看密码子的进化程度。J.Mol.Evol(2003)57:533–537.现有密码子的计算值氨基酸的亲疏水性指数（hydropathicindex）可以用来指示肽链局部的亲疏水程度，以预测它在蛋白质的内部还是外部RNAediting后读框的变化翻译到一半出现的“换马”现象Frame-shiftinproteinsynthesisofRoussarcomavirus“基因中的基因”三个读框同时被利用的例子大肠杆菌ΦΧ174的基因组ProteinBiosynthesis真核细胞中，蛋白质的合成需要：70种以上的核糖体蛋白参与；多于二十种的酶来激活氨基酸；12种或更多的辅酶和其它专一性的蛋白因子来进行肽链合成的起始、延伸、和终止；一百多种酶参与各类蛋白的最后修饰；还需要多于四十种的tRNA和核糖体RNA。共有300多种不同的生物大分子参与且协同地工作来合成多肽。核糖体(Ribosome)是蛋白质合成的场所核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNA组成的亚细胞颗粒，其中蛋白质与rRNA的重量比约为1:2。核糖体是蛋白质合成的场所。原核生物核糖体的组成mRNAtRNA大肠杆菌核糖体的结构（15A）原核与真核生物的核糖体比较大肠杆菌的55个蛋白质和3条rRNA可以在试管中自发折叠成有天然活性的核糖体大肠杆菌中30S的亚基能单独与mRNA结合形成30S核糖体-mRNA复合体，后者与tRNA可以专一性结合。50S亚基不能单独与mRNA结合，但可以非专一地与tRNA结合，50S亚基上有两个tRNA结合位点：氨酰基位点-A、肽酰基位点-P。还有一个GTP结合位点。核糖体上的功能部位核糖体的A部位与P部位：P位和A位，二者紧密连接，各占一个密码子的距离。P：结合起始的氨酰-tRNA和肽酰-tRNA，A：结合新掺入的氨酰-tRNA。P位上肽酰-tRNA上的羧基与进入A位的氨酰-tRNA上的氨基形成新的肽键P位上tRNA卸下肽链成为无负载的tRNA核糖体移动一个密码子的距离，A位上的肽酰-tRNA又回到P位，A位又空，再进行下一次循环。第一步氨基酸的活化ActivationofAminoAcids第二步起始Initiation第三步延伸Elongation第四步终止与释放Termination&Release第五部折叠和修饰FoldingandPosttranslationalProcessingtRNA的结构特征氨基酸的活化•氨基酸的活化由氨酰-tRNA合成酶催化：特异性强，催化特定的氨基酸与特异的tRNA结合，每种氨基酸有特异的合成酶催化，此种特异性保证了遗传信息准确翻译。•氨基酸+ATP+tRNA氨基酰→氨（基）酰-tRNA+AMP+ppi氨基酰tRNA的表示方法丙氨基酰tRNA：Ala-tRNAala精氨基酰tRNA：Arg-tRNAarg甲硫氨基酰tRNA：Met-tRNAmet起始密码子AUG编码的Met由tRNAimet（真核）或tRNAfmet（原核）转运。真核细胞起始密码子编码的Met不须甲酰化大肠杆菌起始密码子编码的Met须甲酰化氨酰-tRNA的合成(Aminoacyl-tRNA)氨酰-tRNA的结构细胞中一般只有二十种氨酰-tRNA合成酶，不同tRNA与同一氨基酸的结合均由同一个酶催化。合成酶有很强的校对功能。酵母蛋白中只有3000分之一的概率Val会被错误地合成到本来应该是Ile的位置中去。核糖体上只对密码子反密码子进行校对，不对AA-tRNA校对氨酰-tRNA合成酶双筛机制确保正确但Ile-tRNA合成酶对Val和Ile的选择性上只有200的差异，剩下的一个数量级的差异在于第二个活性位点的校正功能。tRNA上氨酰-tRNA合成酶进行识别的碱基黄色碱基为识别所需Ala-tRNA的识别特别简单，只有一对G－U碱基I型合成酶多数为单体结构II型合成酶多数为二聚体结构翻译起始（原核）mRNA+30S亚基-IF330S亚基•mRNAIF3-IF1复合物30S•mRNA•GTP-fMet–tRNA-IF2-IF1复合物70S起始复合物mRNA与30S形成复合物,IF1、IF3参与复合物的形成.mRNA中的SD序列与30S的互补序列结合.IF1fmet-tRNA的结合：与以上过程同时发生，fmet-tRNA辨认并与mRNA模板中的AUG结合。反应需IF2,GTP,Mg2+参与;而IF3脱落.50S的结合：50S与30S复合物形成70S启动前复合体,同时伴有GTP水解；IF1IF2脱落,形成了启动复合体.IF2-GTP-fMet-tRNAIF350S亚基IF2+IF1+GDP+Pi70S启始复合物由大、小亚基,mRNA,fmet-tRNAfmet构成核蛋白体上含给位p与受位A，AUG信号与给位相对应结合。同时fmet-tRNA的反密码子CAU与mRNA的AUG互补结合.HowardDintzis1961年证明蛋白质的合成方向从N端往C端标记后分离完整的蛋白质分子进行肽谱分析原核与真核的翻译起始复合物有较大的差别原核翻译起始复合物依赖于16SrRNA与mRNA的相互作用CharacteristicsofmammaliantranslationfactorsNameFunctioneIF1AeIF2eIF2aeIF2BeIF3PromotesMet-tRNAbinding,ribosomaldissociationBindsMet-tRNAandGTPSiteofphosphorylationonSer-51GuaninenucleotideexchangefactorforeIF2Dissociatesribosomes,promotesMet-tRNAandmRNAbindingeIF4AATPase,helicase,bindsRNAeIF4BBindsRNA,promoteshelicaseactivityeIF4ECap-bindingsubunit,partofeIF4FcomplexeIF4GBindseIF4A,eIF4EandeIF3–actsasbridgingfactoreIF5PromotesGTPasewitheIF2andejectionofeIFseIF6Bindsto60Sribosomes,promotesdissociationEukaryoticinitiationoftranslationPrecisesequenceofeventsEukaryotictranslationinitiationcanoccuratIRES一些基因5'端具有一段较短的RNA序列（约150-