复旦微生物学实验课件4 平板菌落计数法和显微镜直接计数法

实验4平板菌落计数法和显微镜直接计数法复旦大学生物科学国家级实验教学示范中心主讲教师：王英明原理微生物数量测定测微生物量计微生物数①显微镜直接计数法②平板菌落计数法③滤膜菌落计数法④MPN法间接计数法/活菌计数法①重量法（干重或湿重）②光吸收法（A600nm）③成分测量法（如核酸法、叶绿素A法等）④生理指标法（如测定呼吸强度、耗氧量和酶活等）在无菌培养皿中加适量菌悬液（或其稀释液），再加入融化并冷却至适当温度（一般约50℃）的固体培养基，混合均匀，平放至彻底凝固，然后适温培养，其中的单个细胞（或单个孢子）形成一个菌落（也可能几个临近细胞形成一个菌落）。根据适当稀释度平板上的菌落数，计算单位体积原始样品中的活菌数，即能够形成菌落的微生物数（单位CFU，Colony-FormingUnits）。本实验采用平板菌落计数法测定环境水样中细菌菌落总数。细菌菌落总数是判定水样污染程度的标志之一，按照GB5749-2006，我国生活饮用水的活菌数小于100CFU/mL。测定细菌总数时，一般采用十倍稀释法稀释样品。原理平板菌落计数法1．样品：地衣芽孢杆菌，0.25g制成2500mL菌悬液。2．培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基。3．仪器：培养箱、灭菌锅和恒温水浴锅。4．其他材料和器皿等：煤气灯、生理盐水、无菌样品瓶、培养皿、无菌试管、移液管、手动移液器、样品瓶（玻璃塞）。材料和仪器10-210-310-4空白对照4.5mL1.0mL融化并冷却至50℃培养基15mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL1.0mL1.0mL1.0mL×2×2×2×1原液10-110-210-310-4×2×2×2×1无菌生理盐水流程计数37℃培养48h1．制备菌悬液2．融化培养基和标记培养皿：牛肉膏蛋白胨固体培养基在105℃融化10min，50℃保温备用。取7块无菌培养皿，用记号笔在皿盖上标记，10-2、10-3、10-4各2块，空白1块。3．水样稀释：取3支无菌试管，依次编号为10-2、10-3、10-4，并在每支试管中加入4.5mL无菌生理盐水。用1支1mL无菌移液管取0.5mL原液，加入到10-1试管中，摇匀。注意，加样时移液管尖端不能接触试管中液体。另取1支1mL无菌移液管从10-1试管中吸0.5mL水样至10-2试管中，混匀，继续稀释至10-4。步骤4．加样和混合平板：取10-4试管中稀释样品1mL，加入相应标记的无菌培养皿中，马上加入约15mL50℃保温的牛肉膏蛋白胨固体培养基，快速摇匀，注意动作要轻柔，以免培养基从培养皿中摇出。平板混好后，马上平放台面至彻底凝固。继续加其他平板和空白对照平板，混合平板。5．培养：凝固彻底的测定平板倒置于37℃培养24h。6．计菌落数：将平板取出，观察并计各个平板的菌落数。注意不同位置菌落形态的差异。7．后处理：样品和培养物用沸水煮沸消毒，清洗。步骤结果*表面的菌落同划线菌落，内部菌落针尖状，培养基和玻璃间菌落薄雾状。*大于500，记作“多不可计”。*平板菌落连成片状或链状少于面积一半，按另外一半平板计菌落数。10-210-310-4空白12平均值1．计各个平板菌落数。例不同稀释度的平均菌落数稀释度菌落数之比结果（菌落总数，CFU/mL）备注10-110-210-3两位以后的数字采取四舍五入法取舍1136516420—1.6ˣ104（或16400）22760295461.6(460/295)＜23.8ˣ104（或37750）32890271602.22.7ˣ104（或27100）415030821.5ˣ103（或1500）5多不可计1650513—5.1ˣ105（或51300）627115—2.7ˣ102（或270）7多不可计30512—3.1ˣ104（或30500）结果2．水样的细菌总数为CFU/mL。注意事项1．采样时样品不要装满样品瓶，样品采集后应尽快测定。2．用移液管取样品前必须混合均匀，移液管也需要润湿。3．加入样品液后，马上加入融化并冷却至50℃固体培养基15mL，轻轻晃动混匀，平放台面，彻底凝固后放入培养箱中培养。4．实验应严格按照无菌操作进行。5．计数时，根据各个梯度的菌落数，给出最后结果。思考题1．测定时，融化后的固体培养基如果在40℃、45℃、55℃和60℃保温，测定结果和50℃保温有何区别？2．本实验测定方法是十倍稀释，各梯度分别取样1mL进行测定。如果只稀释至10-1，取样1mL、0.1mL和0.01mL进行测定，对结果有哪些影响？1．平面图2．侧面图3．放大后的计数室网格改良牛伯耳式1型计数板示意图原理显微镜直接计数法：借助显微镜和计数板，直接对单个的微生物细胞或孢子进行计数，比较直观、简便。比如用血球计数板计酵母菌数改良牛伯耳式1型计数板1．型号，XB-K-252．计数室厚度，0.10mm3．小方格面积，mm24．血盖片1．平面图2．侧面图3．放大后的计数室网格改良牛伯耳式1型计数板示意图原理1．平面图2．侧面图3．放大后的计数室网格改良牛伯耳式1型计数板示意图原理1．平面图2．侧面图3．放大后的计数室网格改良牛伯耳式1型计数板示意图原理①大方格的边长为1mm，计数室厚度0.10mm，即中间大方格体积为0.10mm3。②中间大方格分为25个中方格（双线），每个中方格又被分为16个小方格。③每计数室计4个角和中央，合计5个中方格内的酵母菌数。④根据1个中方格菌数，乘以25，得到1个大方格酵母菌数，再除以1个大方格的体积10-4mL，得到每毫升菌悬液酵母菌数。如果有稀释，再乘菌悬液稀释倍数。显微镜下的血球计数板中央大格，标记数字为五个计数用中格原理•菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。•仪器：显微镜，血球计数板（配血盖片）。•材料和试剂等：煤气灯，接种环，生理盐水，内装玻璃珠的三角瓶，95%酒精棉球，试管，移液管，移液器，吸头，擦镜纸，吸水纸。材料和试剂1.制备酵母菌的菌悬液：酿酒酵母菌PDA斜面菌种一支，用无菌生理盐水，将菌苔洗下，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，制成50mL菌悬液。震荡，混匀。2.清洁血球计数板：镜检计数板，计数室内干净后才可以使用。如果有污物，先用自来水冲洗血球计数板（切勿用硬毛刷刷洗），再用95%的酒精棉球轻轻擦拭，晾干后再次镜检。盖玻片同样清洗和检查。步骤3.加菌悬液：将盖玻片盖在计数室的上面，用细口滴管吹打菌悬液，充分混匀。然后吸菌悬液，滴在计数室和盖玻片的边缘上，菌悬液自然渗入盖玻片和计数板间缝隙中。再用镊子或接种环柄等轻压盖玻片，去除过多的菌悬液，以免实际的计数室体积变大。静置片刻，待菌体自然沉降后，计数。步骤4.计数：在10×倍物镜下（将视野调暗）找到计数室（即方格网），确认计数室无气泡。再找到中间大方格，将其移至视野的正中央，再调至40×倍物镜，计中央大方格四个角的中方格和中间的中方格数。重复计数1次，即得到10个中方格的酵母菌个数。步骤15.计算：①中格的平均菌数⋯…（N，计数的中方格数目）②标准差S=∑ ③菌悬液浓度个稀释倍数④斜面的酵母数=菌悬液浓度×50步骤1.计数室内不可有气泡，若有气泡须重做。每次加菌悬液，都需要清洁计数板。2.菌悬液加入计数板前，必须充分混匀。3.为了计数准确，压在中方格双线上的菌体，只计数压在上侧和左侧双线上的菌体。4.计数时，对未分离的芽体和母细胞，当芽体大于或等于母细胞体积一半时，记作2个。小于母细胞体积的一半时，记作1个。注意事项1.保养显微镜。2.菌种管用沸水煮沸消毒，清洗。3.实验结束后，先用自来水冲洗血球计数板，再用酒精棉球擦洗，最后用擦镜纸擦干。血盖片也进行同样的处理。实验后处理1.血球计数板可以用来计数哪些类型的微生物？2.为什么采用血球计数板计总菌数时，计数室内不能有气泡？3.加菌悬液后用镊子按压血盖片的目的是什么？4.试分析影响本实验误差的因素，并提出改进建议。思考题谢谢