复旦微生物学课件9- 微生物生长及其控制

第六章微生物的生长及其控制1•微生物生长繁殖的定义微生物生长是细胞物质有规律的、不可逆的增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，引起生命个体数量增加的生物学过程。群体生长=个体生长+个体繁殖在微生物学里,生长定义为群体生长，注重于个体数量的增加。2•微生物生长繁殖物质合成：结构单体的合成多聚化核苷酸合成DNA复制、RNA转录氨基酸合成多肽、蛋白质合成3细菌中DNA的复制和细胞分裂两个过程的控制是不连接的。一、染色体DNA的复制和分离二、细菌的分裂与调节杆菌球菌Binaryfission细胞壁扩增以数量变化对微生物生长情况进行测定1、培养平板计数法2、膜过滤培养法3、显微镜直接计数法以生物量为指标测定微生物的生长1、重量法2、生理指标法3、比浊法第一节测定微生物生长繁殖的方法6•1、重量法：–可以用于单细胞、多细胞及丝状体微生物–湿重：离心或过滤分离菌体，洗涤，直接称重。发酵：g菌/L–干重：105℃烘干至恒重•2、生理指标法–蛋白质量：细菌中蛋白质含量大约为65％，蛋白质含氮量16％，凯氏定氮法（蛋白质→氨离子→蒸馏→滴定）–DNA，ATP等含量–微生物的呼吸强度，耗氧量，酶活性，生物热以及产酸、产气等“吹口气查胃病”：13C尿素呼气法快速鉴定幽门螺杆菌（尿素酶）感染（NH3和13CO2）以生物量为指标测定微生物的生长7在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。相对值，不能区分死活菌83、比浊法以生物量为指标测定微生物的生长•直接计数法：显微镜，细菌计数板、血细胞计数扳•间接计数法：（活菌计数法）–平板菌落计数法cfu(colonyformingunit)菌落形成单位e.g.:100cfu/ml•MPN方法：最大或然数（mostprobablenumber)计数法稀释液体培养计数•膜过滤法：主要用于液体样品中菌数很低时3、计数法：细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量以数量变化对微生物生长情况进行测定9直接计数法：显微镜、细菌计数板/血细胞计数扳10Procedureforviablecountingusingserialdilutionsofthesampleandthepourplatemethod.间接计数法：（活菌计数法）平板菌落计数法cfu(colonyformingunit)菌落形成单位e.g.:100cfu/ml159*5*10311Twomethodsofperformingaviablecount(platecount).Ineithercasethesamplemustusuallybedilutedbeforeplating.浇注平板涂布平板12MPN方法：最大或然数（mostprobablenumber)计数法，又称稀释液体培养计数。适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。13膜过滤法：主要用于液体样品中菌数很低时14•哪些方法在厌氧菌的测定中可以使用？•哪些方法在混合微生物的测定中可以使用？•哪些方法适合于高浓度微生物（如：粪便）检测，哪些方法适用于饮用水中的微生物检测？•有多种微生物混在一起的情况下我要检测其中某一种微生物量，应该怎么做？15第二节微生物的生长规律了解细菌群体生长规律,对其进行研究与利用细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念与方法）16一、同步培养(Synchronousculture)2、机械筛选法（1）密度梯度离心法（2）过滤分离法（3）膜洗脱法1、环境条件诱导法（1）温度（短期热休克法）（2）培养基成分（用氯霉素抑制细菌蛋白质合成）（3）明显的生理周期（藻类细胞的光照、黑暗控制）研究微生物个体生长的方法(间接)生理与遗传特性的研究；工业发酵的种子；同步培养物：一种理想的材料17硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。18典型生长曲线（growthcurve）：定量描述群体菌数变化规律时间为横坐标、活菌数对数作为纵坐标生长速率常数(growthrateconstant)（R:每小时分裂次数）延滞期Lagphase对数生长期Exponentialphase稳定生长期Stationaryphase衰亡期Deathphase二、细菌群体生长规律19特点：生长速率接近零细胞形态变大或增大rRNA含量增高合成代谢十分活跃对环境比较敏感原因：（1）种子老化（2）适应新环境的酶系统没有表达解决方法：（1）接种龄–指数期种子最好（2）接种量–实验室：3-5%，工业发酵：~10%（3）培养基：发酵与种子培养基成分接近1、延滞（迟缓）期20•特点：–生长速率常数最大–菌体成分均匀–代谢旺盛•影响指数期微生物代时长短的因素–菌种–营养成分–营养物浓度–培养温度2、指数（对数）期：生长限制因子（growth-limitedfactor)：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。对数期菌种是研究微生物基本代谢的良好材料；也常在生产上用作种子，使发酵的迟缓期缩短指数期的三个参数：N，繁殖代数G，代时（倍增时间）R，生长速率常数t1–t0G=———nR=1/G21n，繁殖代数22设大肠杆菌在接种时细胞浓度为100个/ml，经400分钟的培养，细胞浓度增加到10亿个/ml,求该菌的世代时间和繁殖代数。Relationshipbetweennutrientconcentration,growthrate(greencurve),andgrowthyield(redcurve)inabatchculture(closedsystem).Atlownutrientconcentrationsbothgrowthrateandgrowthyieldareaffected.Y=(X-X0)/(C0-C)生长得率3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物成分，就称为生长限制因子，用C表示，稳定期C=0生长得率：Y=(X-X0)/(C0-C)X：微生物生物量C:底物量23•特点：•生长速率为零（增量等于死亡数)，活菌数最多•开始储存糖原等内含物•芽孢杆菌：形成芽孢•次生代谢物（secondarymetabolites)•原因：•营养物质耗尽/比例失调/pH、氧化还原势等环境变化3、稳定生长期：生产上延长稳定期的方法：补料或取走代谢产物、调节pH、温度、对好氧菌增加通气、搅拌获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物24•现象：•代谢活性降低、衰老自溶(autolysis)•芽孢杆菌：释放芽孢•原因：•营养物质耗尽•有毒代谢产物大量积累4、衰亡期（deathphase)：25二次生长曲线与葡萄糖效应•葡萄糖效应当培养基中存在葡萄糖时，其他碳源的利用会严格受到抑制，直到葡萄糖完全消耗为止。Jacob和Monod首次研究了葡萄糖效应，提出了操纵子概念，由此获得了诺贝尔奖。他们的工作开创了原核基因调控的时代。迟缓期1迟缓期2对数生长期1对数生长期2速效源迟效源稳定期26基本原则：不断补充营养物质移出培养物按照控制方式分：恒化器连续培养（外控制）恒浊器连续培养（内控制）三、连续培养(开放培养)在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上的一种培养方法。开27单批培养（密闭）-----连续培养（开放）28恒浊：微生物量恒定（菌体密度）过量的必需营养物，菌体维持最高的生长速率。恒化：控制培养液流速（保持不变）及R；通过调节限定因子浓度，使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。获得菌体及与菌体生长相平行的代谢产物。获得一定生长速率的均一菌体，及稳定菌体密度的菌体。按照培养器级数分：•单级连续培养（如单批恒浊）：产物产生速率与菌体生长速率相平行•多级连续培养器（multi-stepcontinuousfermentor)：产物与菌体生长速率不平行–丙酮、丁醇发酵（byClostridiumacetobutylicum丙酮丁醇梭菌)•前期：菌体生长期（trophophase)37ºC,dilutionrate:0.125/h•后期：产物合成期（idiophase)33ºC,dilutionrate:0.04/h29连续培养的应用例子：生活污水微生物净化30四、微生物的高密度培养（highcell-densityculture,HCDC)•超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术–E.coli工程菌生产多肽类药物的实践中发展•E.coliW3110:174g（湿重）/L•进行高密度培养方法–选取最佳培养基–适时补料–提高溶解氧浓度–防止有害代谢产物生成–保持合适pH31第三节影响微生物生长的主要因素32温度、氧气、pH温度三基点（对同一种微生物）：最适、最高、最低生长温度一、温度33Effectoftemperatureongrowthrateandthemolecularconsequencesforthecell.Thethreecardinaltemperaturesvarybyorganism.温度对微生物生长的具体影响：（1）酶活性；（2）细胞质膜的流动性（低温凝固，高温破裂）；（3）物质的溶解度。3435对微生物群体而言350℃Growthofhyperthermophilesinboilingwater.YellowStoneNationalPark37二、氧气专性好氧菌兼性厌氧菌耐氧菌微好氧菌厌氧菌38超氧化物歧化酶过氧化氢酶1971年McCord和Fridovich提出关于专性厌氧生活的超氧化物歧化酶（SOD）学说。关于厌氧菌的氧毒害机制在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2·）等。超氧阴离子自由基为活性氧，性质极不稳定，反应力极强，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶等，严格厌氧菌缺乏SOD等，故不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。39氧的毒副作用及其解毒超氧化物歧化酶(SOD）过氧化氢酶过氧化物酶好氧菌耐氧菌关于厌氧菌的氧毒害机制40Caption:Methodfortestingamicrobialcultureforthepresenceofcatalase.Aheavyloopfulofcellsfromanagarculturewasmixedonaslidewithadropof30%hydrogenperoxide.Theimmediateappearanceofbubblesisindicativeofthepresenceofcatalase.ThebubblesareO2producedbythereactionH2O2+H2O22H2O+O2.检测过氧化氢酶：待检菌（悬液）上滴一滴30%H2O2，观察气泡情况•对不同类型微生物采取不同的培养方式：–好氧：振荡、通气–专性厌氧：除氧，加还原剂–耐氧型：深层静止培养–厌氧产气袋？–是由日本三菱瓦斯化学株式会社发明并拥有专利的一类产品，其基本原理是将密闭空间中的氧气完全或者部分吸收掉，然后产生二氧化碳。–铁粉、Vc、活性炭等柠檬酸+碳酸氢钠----二氧化碳42三、pH43•pH对微生物生长的具体影响：–细胞内环境中的pH却相当稳定，胞内酶的最适pH接近内环境pH–周质空间的酶和胞外酶的最适pH则接近环境pH直接影响：酸破坏DNA、ATP、叶绿素等碱破坏RNA、磷脂间接影响：（1）营养物质的离子化程度（2）营养物质的吸收（3）有害物对微生物的毒害（4）代谢反应中各种酶活性44•微生物代谢活动可