复旦微生物学实验课件8 酸奶中乳酸菌的分离和菌种保藏

实验8酸奶中乳酸菌的分离和菌种保藏复旦大学生物科学国家级实验教学示范中心主讲教师：王英明灭菌材料准备每组MRS琼脂一瓶，150mL／瓶，倒十块平板马铃薯葡萄糖半固体斜面4支酸奶牛奶或羊奶的乳酸菌发酵产品。乳酸菌能发酵糖类产生乳酸的细菌。革兰氏阳性，杆菌或球菌，无芽孢。巴斯德1857年发现乳酸菌引起葡萄酒变酸，发明巴斯德消毒法，拯救了法国的葡萄酒工业。原理梅契尼科夫1900年发现，保加利亚莫斯利安人长寿和常喝酸奶有关，从酸奶中分离到保加利亚乳杆菌，创建酸奶工业。乳酸菌的价值：1.营养价值：分解乳糖，产生乳酸。2.保健活性：调理肠胃，促进消化3.免疫调节活性。益生菌（双歧杆菌等）益生元（寡聚果糖等）合生元梅契尼科夫原理酸奶中常用的乳酸菌•乳杆菌属：德氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌（LGG），干酪乳杆菌•双歧杆菌属：两歧双歧杆菌，长双歧杆菌，婴儿双歧杆菌•链球菌属：嗜热链球菌•乳球菌属：乳酸乳球菌鼠李糖乳杆菌长双歧杆菌酸奶中乳酸菌分离（MRS）GB4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验乳酸菌计数用MRS原理菌种保藏采用干燥、低温、缺氧等条件抑制微生物的新陈代谢和生长繁殖，长期保持微生物的不乱、不死、不变。一般保藏纯培养，优先选择休眠体（芽孢和孢子）。常用方法适用菌种保藏原理备注斜面保藏法绝大多数斜面培养物，4℃应换橡胶塞半固体穿刺法细菌和酵母菌半固体穿刺培养物，4℃石蜡油/橡胶塞甘油法（DMSO法）绝大多数菌悬液加甘油，-20/-80℃*液氮法绝大多数加DMSO/液氮（-196℃）最有效砂土管法休眠体砂土管中加菌，干燥低温，熔封更佳滤纸片法细菌、放线菌和真菌滤纸片上加菌，干燥低温，熔封更佳*冷冻真空干燥法绝大多数菌液加保护剂，低温抽真空冻干，熔封4℃或室温保藏1.菌种：市售酸奶。2.培养基：MRS琼脂培养基。3.试剂：厌氧指示条，变色硅胶，厌氧产气袋AneroPack-Anaero2.5L，草酸铵结晶紫染色液。4.设备：恒温培养箱，方形培养盒（2.5L），显微镜。5.器皿等：煤气灯，电子点火器，载玻片，接种环，试管和无菌培养皿等。材料和仪器1.酵母菌的半固体穿刺接种酒酿实验分离的酵母菌斜面，接种针取菌，穿刺接种，28℃培养3~4天，观察生长情况。2.酸奶中乳酸菌的划线分离（1）倒MRS平板；（2）取市售酸奶，划线分离，每一个同学划线4~5块平板；（3）取2块平板放在37℃，培养3~4天，观察生长情况和菌落特征。（4）其余平板厌氧培养3~4天，观察生长情况和菌落特征。（5）简单染色，观察个体形态特征。实验步骤干燥剂方形培养盒2.5L厌氧指示条厌氧产气袋大格中格小格步骤①平板倒置于方形培养盒的大格中。②如平板较湿，在中格加入变色硅胶适量。③取一个厌氧指示条，湿润后加入小格中。④撕开厌氧产气袋外包装，马上放入中格，半分钟内密封。刚放入培养16h后变色硅胶AneroPack-Anaero厌氧指示条AneroPack-Anaero步骤德氏乳杆菌保加利亚亚种唾液链球菌嗜热亚种结果1．除双歧杆菌属是专性厌氧微生物外，酸奶中其余常用乳酸菌都是兼性厌氧微生物或耐氧厌氧微生物，可以在空气中培养，但生长缓慢。加入厌氧产气袋后，培养盒必须尽快密封。2．划线分离时，酸奶较粘稠，应在A区充分划线，才能获得理想的分离效果。如时间允许，应增加一次乳酸菌的纯化。3．一般来说，MRS平板培养，杆菌菌落大，球菌菌落小。酸奶中双歧杆菌属不易分离到，可以在MRS培养基中加入莫匹罗星锂盐，选择性培养双歧杆菌属。4．厌氧产气袋的外包装撕开后半分钟内密封好方形培养盒。培养过程中不得打开培养盒。如果开盒，必须重放一个厌氧产气袋。5．培养皿最好准备，表面干燥后再使用，否则需要在盒中加入适量变色硅胶。注意事项1．市售酸奶的成分很多，选一种市售酸奶说明各成分的用途。2．乳酸菌除了用来制作酸奶，还有哪些应用？3．乳酸菌在正常生物体的体内/体表有哪些功能？4．酸奶发酵一般采用哪些混合菌发酵，为什么？5．常温酸奶，相比于低温酸奶和鲜牛奶，有哪些优点和缺点？思考题