复旦细胞生物学实验教案

细胞生物学实验教案实验一几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察一、实验目的学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术二、实验原理在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为5－6nm，主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质（静止的）外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有1µm的距离，与胞质川流运动无关，主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输的作用。另外，用秋水仙素与细胞松弛素B处理也可产生不同的结果。经秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰乱，但不影响川流运动，这是与秋水仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素B处理，就可抑制细胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。三、实验材料新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。四、实验器材相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水纸，剪刀，滴管，擦镜纸。五、实验药品100µg/ml秋水仙素溶液，20µg/ml细胞松弛素B(cytochalasinB)，蒸馏水，香玻油，二甲苯。六、实验步骤1.取新鲜洋葱鳞茎内表皮约1cm2或更小，放在干净的载玻片上，加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。2.取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。3.把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察，可以看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢），水封片中多加些水会促进这种运动。4.学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关操作技术。实验二植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。五、实验药品1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／LKCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸)，0.1mmol／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT)。lmol／LHCl调pH到6.820.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3.1％TrltonX—100，用M—缓冲液配制。4．0.2％考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。·5.3％戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制6.50％，70％，95％乙醇。7.叔丁醇8.正丁醇9.二甲苯。10.中性树胶。六、实验步骤1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。2．吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。3.吸去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。4.用3％戊二醛固定0.5h。5.再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。6.0.2％考马斯亮蓝R250染色20—30min（在染色板上）。7.用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。8.如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V95％乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤5—10min)。然后，将样品置于载玻片上展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。实验三叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二、实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。三、实验材料新鲜菠菜叶四、实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。五、实验药品匀浆介质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／LTris—HCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心l.洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。2.加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。4.滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。5.在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。7．离心8000r／min，20min。8.取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧光显微镜观察。(二)菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。七、实验结果(一)叶绿体的分离和观察1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.以Olympus荧光显微镜为例，在选用B《blue》激发滤片、B双向色镜和0-530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。（二）菠菜叶手切片观察1．在普通光镜下可以看到三种细胞，(1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。(3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3．用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发绿色荧光，气孔仍为绿色。实验四细胞组分的分离一、实验目的掌握分级分离方法。二、实验原理利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将各组分逐级分离出来。三、实验材料小鼠(30克)取肝脏四、实验器材同实验七外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速冷冻离心机。五、实验药品匀浆介质(0.25mol/L蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一詹纳斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml，0.25mol/L蔗糖溶液中)。其中0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：0.lmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)10ml，0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。六、实验步骤1.低速离心分离细胞核(1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。，(2)称取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质洗涤数次。(3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至Corex离心管中，同时制备l张滤液涂片，做好标记，自然干燥。(4漓心机上500r／min离心5min(4℃)，将上层溶液吸入2支eppendof管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。沉淀物作进一步处理。(5)用5ml匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以1000r／min离心10min(4℃)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml匀浆介质，用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记，自然干燥。2.高速离心分离线粒体(1)将步骤l(4)中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以10000r／min离心5min，缓缓吸出上清液至另2eppendorf管，留取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。(2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r／min离心5min。(3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。3．分离物的鉴定(1)细胞核。将步骤l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min，吹干，滴姬姆萨染液(原液用1／15mol磷酸缓冲液稀释10—20倍)染色10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜下比较观察涂片。(2)线粒体。在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红—詹纳斯绿染液，取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片上，染色30min后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。附：更精致的分离方案将4.5ml0.34mol／L蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入4.5ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700×g离心10min，得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml0.25mol／L蔗糖溶液洗2次，每次1000×g离心10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层，经700×g离心10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。（2）细胞核纯化：将沉淀用5倍体积的0.34mol／L蔗糖0.5mol／LMg(Ac)2溶液混悬，铺在4倍于核悬液体积的0.88m01'／L蔗糖—0.5mol／LMg(Ac)2溶液之上，1500×g离心20min，沉淀物即为纯化的细胞核。（3）分离核仁：纯化的细胞核混悬在2倍体积的0.34mol／L蔗糖—0.5mol／LMg(Ac)2溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质pH中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于4倍体积的0.88mol／L蔗糖—0.5moI／LMg(Ac)2溶液之上，1700×g离心17min。沉淀物即为核仁，溶液为上清液I。将上清液I10000×g离心lOmin得上清液Ⅱ和沉淀物，沉淀物以lO