复旦药物分析课件16抗生素类药物的分析

第十六章抗生素类药物的分析第一节概述一、抗生素药物的定义和特点定义：抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。抗生素的来源：1.生物合成（发酵）2.化学合成或半合成特点：1.化学纯度较低同系物多异构体多降解物多2.活性组分易发生变异3.稳定性差分类（按结构与性质）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类、蒽环类、其他抗生素类二、抗生素的分类三、抗生素药物的细菌耐药性耐药性的种类；耐药的机制抗生素质量的复杂性产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂四、抗生素药物的质量分析（二）检查：（一）鉴别：官能团的呈色反应光谱法、色谱法、生物学法1.影响产品稳定性的指标：水分2.控制有机和无机杂质的指标3.与临床安全性密切相关的指标:异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌4.其他检查项目(三)含量或效价测定（一）微生物检定法:管碟法和浊度法测定抗生素抑菌或杀菌的能力，结果以效价表示优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长2、测定误差大（二）理化方法以理化方法测定主药含量优点1.专属性强2.准确度高3.简单、快速不一定代表生物效价缺点（三）抗生素活性表示方法NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第二节β–内酰胺类抗生素青霉素类CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素（青霉素G、苄青霉素）头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCONSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性结构与性质一、Na与碱金属(Na+、K+)成盐（一）羧基易溶于水与有机碱(普鲁卡因)成盐难溶于水普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO1234567（二）旋光性87654321NOS头孢菌素类C6C7青霉素类C3C5C6（三）紫外吸收特性NSO头孢菌素类母核有共轭体系青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基NOS（四）β–内酰胺环水溶液不稳定干燥纯净稳定不稳定性因素四元环张力大酰胺键易水解（某些金属离子）（温度）失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶某些氧化剂例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶(头孢噻吩钠水溶液25℃24h失活8%)色谱法（一）1、TLC法对照品对照法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR2、HPLC法Rt比较供试品对照品相同条件二、鉴别试验1、IR法117401815cm~VOC116901710cm~VOCβ-内酰胺环酰胺（二）光谱法2、UV法A,Emin,max,,%cm光谱图样品、分解产物头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50苯唑青霉烯酸苯唑青霉素HCu2+nmANOCONHCH3NOSCH3CH3COONaNOCHCH3OCOCNHNCHHCCH3CH3SHCHCOOHCu2+pH3.8△（三）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOHHClNOHH内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+/3H+NSONSCOHNHOHNSCHNHOFe3+3ONH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22.茚三酮反应蓝紫色氨基茚三酮△α-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RCOH2RCHH2NCOOH2OHCCOCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO3.与重氮苯磺酸反应:酚羟基SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNNCH3NClNNaO3SOH（偶合）NNNNCH3SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNaO3S（四）各种盐的反应1.K+、Na+反应2.重氮化-偶合反应青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素H重氮化-偶合反应红三、特殊杂质检查1、聚合物：分子排阻色谱法凝胶色谱柱－分子筛机制，色谱柱采用亲水硅胶、凝胶或葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶；流动相为水或缓冲液如：头孢他啶聚合物的测定固定相：葡聚糖凝胶G-10（40120µm）流动相A：3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液流动相B：水检测波长：254nm对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。N不低于900，拖尾因子2，峰面积的RSD应小于5.0%。测定方法：进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。2、有关物质和异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查反相HPLC法固定相：ODS；流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）3、吸光度杂质吸光度、药物吸光度4、有机溶剂气相色谱法测定溶剂残留量5、结晶性偏光显微镜法和X射线粉末衍射法内标法＋校正因子外标法特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）四、含量测定反相高效液相色谱法第三节氨基糖苷类抗生素氨基糖苷苷元氨基糖缩合链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、巴龙霉素等NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺链霉素化学结构ROCR1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺庆大霉素庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H性质：1.碱性多与硫酸成盐2.溶解性3.旋光性4.苷的水解和稳定性：酸性、碱性均易水解链霉素pH5～7.5；庆大霉素pH2～12稳定5.UV：链霉素:230nm、庆大霉素等无二、鉴别试验茚三酮反应（一）蓝紫色庆大霉素链霉素茚三酮△羟基胺结构（二）Molisch试验具有五碳糖或六碳糖结构H+糠醛或羟甲基糠醛α-萘酚蒽酮红紫色蓝紫色N-甲基葡萄糖胺反应（三）甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色（Elson-Morgan反应）NHCH3NHNHNHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNCH3COCH3HHOCH2CHOH3(缩合)323COCHCOCHCHOH乙酰丙酮吡咯衍生物HHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3N对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色麦芽酚反应（四）链霉糖特有反应链霉糖链霉素OH麦芽酚紫红色3FeH+分子重排NHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2ONaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红麦芽酚链霉胍特有反应橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠8OH（或α-萘酚）NOH8-羟基喹啉坂口反应（五）ONBrRNHCONH橙红色化合物（六）24SO反应白BaSOSOBaH+IR法（八）庆大霉素无UV吸收nmmax链霉素（七）色谱法：TLC法和HPLC法UV法光谱法：三、特殊杂质检查及组分分析链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）2.方法TLC中的对照品法1.来源反应中间体对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分的测定（二）ChP（2010）采用蒸发光散射检测器测定庆大霉素C组分，以C18作固定相；0.2mol/L三氟乙酸－甲醇作流动相，小诺霉素作内标，考察系统适用性（三）硫酸盐测定：剩余EDTA络合滴定法或HPLC法ChP（2010）中硫酸依替米星中硫酸根离子的测定采用HPLC法-蒸发光散射检测器四、含量测定微生物检定法各国药典主要采用HPLC法常用于体内药分2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1第四节四环素类抗生素ABCD2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1一、结构与性质酸碱性与溶解度（一）1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑3.吸湿性多含结晶水酚羟基、烯醇型羟基弱酸性二甲胺基弱碱性与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+UV和荧光（三）与金属离子络合（四）pH3~7.5荧光旋光性（二）HOHOCaOOOOHOHOO稳定性（五）1.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～pHOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHO差向四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（土霉素、多西环素不易差向异构化）2.降解反应（1）酸性下降解脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜pHλmax=445nmλmax=435nm橙黄色2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HONCH32HOHCONH2OOHOOHCH3OH脱水四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOpH26～pH26～TCOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOETCNCH32HOHCONH2OOHOOHCH3OHATCN2CH3OHCONH2OOHOHOHOCH3HEATCpH2＜pH2＜（2）碱性下降解异四环素四环素OH（荧光）HOHCONH2OOHOHOOHCH3ONCH322、TLC法1、HPLC法：加入EDTA，克服痕量金属造成的拖尾现象二、鉴别试验3、IR光谱法4、UV光谱法5、显色法，与H2SO4反应显色黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素SOH6、FeCl3反应：酚羟基的特征反应褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素FeCl三、特殊杂质检查4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）有关物质（一）HPLC法（2010版）标准品对照法CTC).~.(Anm控制（二）杂质吸收度EATCATC.Anm、控制异四环素控制.Anm注射用（三）残留有机溶剂四、含量测定HPLC法盐酸四环素的测定系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求。定量方法：外标法以峰面积计。第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查1.高分子杂质分子量大于药物本身的杂质总称。如主要来自于发酵工艺可致敏的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽；来源于生产、贮存过程中的自身聚合物等。如聚合物高分子杂质的分析方法简单测定系统：葡聚糖凝胶G-10（40～120μm）柱.HPLC系统:葡聚糖凝胶G-10柱.