复旦医学遗传学实验指导02细胞的遗传物质

1第二篇细胞的遗传物质第一章细胞内核酸的提取人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验技术中基本的操作之一，第一节真核细胞基因组DNA的分离与纯化DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。一、裂解细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。裂解液一般都含有去污剂(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，一方面提供一个合适的裂解环境(如Tris)，另一方面可抑制核酸酶在2裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl)。裂解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。二、纯化根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。三、DNA提取的实验步骤（一）材料与设备1.试剂消化液（100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl，pH8.0，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/LEDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇；95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1μg/mlRNA酶；2.仪器培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头；离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱（二）主要步骤1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl，pH8.0，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g×5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。4.冷却至4℃，加等体积15mo1／LTES饱和酚。5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。6.4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。38.DNA溶液再加等体积15mo1／LTES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。13.用75%冷乙醇清洗3～4次。14.室温干燥或冷冻干燥DNA。15.加适量TE溶液溶解DNA。四、结果鉴定1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μlDNA溶解液，适量稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，比值在1.72.0:1之间，说明DNA纯度可。在260nm处，1OD双链DNA的浓度为50g/ml，据此可计算DNA的浓度（g/ml）=50×(OD260)×稀释倍数。2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取2μlDNA溶解液与适量上样缓冲液混合后，经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照；如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明DNA完整性好。第二节真核细胞总RNA的分离提取RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，4包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。一、RNA提取的关键真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。二、组织RNA提取的基本步骤1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。3.主要步骤（1）取组织50~100mg，加0.8mlTrizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。（2）加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4℃，12000g×15min离心。弃沉淀。（3）取上清，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置2h，4℃，12000g×10min离心。（4）弃上清，取沉淀，加入1ml75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min离心。（5）弃上清，沉淀真空干燥10min。（6）加40μlDEPC溶液，充分溶解RNA。4.结果鉴定（1）紫外分光光度计检测：取RNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，如果比值在1.72.0：1之间，说明RNA纯度可。5标准样品当OD260＝1时，RNA浓度约为40μg/ml，根据下述公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。（2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量，电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制1%甲醛变性凝胶板：4.5μlRNA，2ul5×甲醛胶电泳缓冲液，3.5μl37%甲醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μlRNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28SRNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。三、注意事项1、所有玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1%DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。2、实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。第三节质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb200kb的DNA，存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒DNA是基因克隆的前提条件。一、碱裂解法提取质粒DNA的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH1212.5时,线性DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性，只能聚合成网状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA可用乙醇沉淀出来。6二、基本步骤1．材料：含质粒的大肠杆菌2．试剂：溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）)、溶液Ⅱ（0.2NNaOH，1%SDS）用时临时配制。pH4.8的醋酸钾（KAc）缓冲液（5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml）、TE缓冲液（10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)）、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）、5×TBE（Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml）。10mg/ml溴化乙锭（EB）、琼脂糖、10mg/mlRNaseA（RNA酶A）、6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。3．仪器：离心机、电泳仪、水平式电泳槽4.主要步骤（1）挑取LB固体培养基上生长的大肠杆菌单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。（2）取1.5ml培养物转移入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜充分裂解。（5）加入150μl预冷的醋酸钾（KAc）缓冲液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。（6）加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀，4℃离心12000g×10min。（7）小心移出上清于另一微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。（8）加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。（9）沉淀溶于20μlTE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。5.结果鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸DNA的鉴定。7第四节线粒体DNA的提取线粒体DNA是染色体遗传物质，哺乳类动物的线粒体DNA为共价闭合环状的双链DNA。它变异快、结构相对简单，经母系遗传，对真核生物基因组的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近缘种间或种内种群间亲缘关系的研究。线粒体DNA最早是用氯化铯梯度离心方法获得，该法提取的线粒体DNA纯度高，但所需仪器设备昂贵，实验周期长，限制其在群体遗传研究中的应用。继而出现了Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体DNA的提取方法。一、