复旦医学遗传学实验课件02细胞损伤与保护2

细胞实验（二）细胞损伤与保护2•设3组不同的细胞组正常、损伤、损伤恢复•用不同的实验方法检测、验证实验结果实验内容•细胞电子显微镜检测•细胞活率测定•亚细胞结构的分离与鉴定实验设计1.（电镜）每班传细胞入含小盖片培养瓶6瓶（2组）2瓶正常、4瓶损伤、第二天2瓶损伤后恢复2.（活率）每组传细胞入96孔培养板9孔3孔正常、6孔损伤、第二天3孔损伤后恢复3.（分离）每班传代细胞8瓶4瓶细胞1传2至25ml培养瓶成8瓶细胞细胞电子显微镜检测细胞电镜标本制备原理光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构，我们把这些细微结构称为亚显微结构（submicroscopicstructures）或超微结构（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。要看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子显微镜与光学显微镜的结构，从原理上来说是相似的，但也有不同之处。•首先不同的是用电子束（电子流）代替照明光源。•其次，电镜使用的是电子透镜，而不是光学透镜，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜，它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。•第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后，造成电子散射角度不同，使荧光屏上的电子强度也相应不同。电镜制样技术由于电子束的穿透能力有限，为了获得较高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为40～50nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性，为此，样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。超薄切片的制备1、固定：戊二醛和（OsO4）等，锇酸后固定。2、包埋：环氧树脂和丙烯酸树脂等。3、切片：玻璃刀用超薄切片机切片，厚度40～50nm，切片收集在铜网或镍网上，在电镜下观察。4、染色：常用的染色液是醋酸双氧铀（易染核酸）和铅盐（易染蛋白质）。结果•在电子显微镜下观察比对正常、损伤及损伤后恢复标本•照相•分析•总结要求•送标本•照片结果分析细胞活率测定MTT比色法原理•四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受Ｈ原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶，能使外源性淡黄色的(MTT)还原成难溶于水的结晶，并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。器材与试剂•器材：培养细胞(96孔细胞培养板)酶标仪、移液抢、抢头等•试剂：5mg/mlMTT溶液二甲亚砜（DMSO）溶液DMEM培养液（高糖、无糖）实验步骤1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板：每组9孔2、每孔加200ul培养液：3孔正常（高糖）、3孔损伤（无糖）、3孔损伤恢复（无糖有糖），37oC、5%CO2、饱和湿度下培养；3、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养液180ul、再加MTT溶液20ul，继续培养；4、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO溶液150ul，振荡5分钟；5、酶标仪492nm波长处比色。5h结果•记录酶标仪上光吸收值•分析每组细胞生长情况注意事项•每孔的细胞密度不能超出1x105/ml，避免影响实验的区分度；•高浓度血清会导致实验本底增高，比色前尽量使血清浓度不超过10%。亚细胞结构的分离与鉴定细胞核的提取原理细胞内各种细胞器质量不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。•本实验利用此原理仅对细胞核进行分离、鉴定，其上清液可作进一步分离。器材与试剂•细胞株CHL•离心机、天平、离心管、显微镜、染色缸、滴管等•消化液、0.075MKCl、0.25%蔗糖溶液、甲醇固定液、Giemsa染液操作收集细胞（消化法）——离心(1000/min×5’)——沉淀加0.075MKCl4ml，冲打，静置20min——离心(1500/min×10’)——取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀——离心（2500/min×10’）——取沉淀加少量固定液涂片——酒精灯烤干——甲醇固定5’——Giemsa染色5’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片（反面）——显微镜10倍或40倍下观察（鉴定）结果•细胞核染成深兰色注意事项•注意正确使用离心机（平衡、对称）•正确使用显微镜•染液临用前稀释（PBS：Gimsa原液9：1）back告知实验（三）Bax蛋白在不同细胞中表达差异检测（免疫组化法）试验前准备•细胞模型制备与MTT法同准备•96孔板8块、细胞6瓶•2个班公用1块板，使用前照射半小时。每班8组，96孔板重复使用，周边留空。每组接种细胞9孔、200ul•4瓶传代•1瓶加10mlDMEM液，做MTT•1瓶加6mlDMEM液接种小盖3瓶，