复旦医学遗传学实验课件08遗传病分析5：基因组DNA提取与PCR扩增技术

遗传病分析5基因组DNA提取与PCR扩增技术一、基因组DNA提取实验目的•基因组DNA的制备是基因分析的前提。•本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。原理DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等，破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。原理基因组DNA提取试剂盒：在高盐的状态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。器材与试剂•台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等•试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱）、TE缓冲液操作1、将全血轻轻混匀，转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中，颠倒混匀5-6次，室温，3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec；2、取沉淀，加1mlGN结合液悬浮沉淀，颠倒混匀，5000r/min离心×3sec；3、取沉淀，加0.5ml漂洗液纯化树脂2次，颠倒混匀，5000r/min离心×3ecs；4、取沉淀，加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀，颠倒混匀；装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙醇液；5、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液；6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入100ulTE缓冲液于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。注意事项•一般情况下，纯净的DNAOD260/OD280比值约为1.8，RNA为2.0。若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。若DNA的比值1.75，则加入SDS至0.5%；•从核酸中去除蛋白质时，常用到酚：氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离；•DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。二、PCR扩增技术实验原理•多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为：•在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。实验原理•加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。•降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。•溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。•如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。实验原理实验目的本实验以所提出的全血基因组DNA为模板，以线粒体基因上一段核苷酸为引物，扩增出924bp的扩增产物。学习并掌握PCR反应的基本原理与实验技术。器材和试剂器材PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等器材与试剂试剂：1、PCR试剂盒：（TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg＋＋等）2、引物1（68kb上游）引物2（69kb下游）3、无菌ddH2O4、模板DNA：为本次实验所提出的全血基因组DNA操作•无菌ddH2O21.5ul•Taq酶等25ul•引物1（68）0.6ul•引物2（69）0.9ul•模板DNA2ul混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪总体积50ul操作PCR扩增的设定：设置PCR扩增仪的热盖温度为100℃•预变性：94℃5min•循环：94℃变性30s56℃退火30s30个循环72℃延伸30s•末次延伸：72℃5min•4℃保存注意事项•由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。•最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA，加模板DNA时不要形成喷雾。•若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。