复旦医学遗传学实验课件09遗传病分析6：DNA扩增产物的鉴定

遗传病分析6DNA扩增产物的鉴定限制性内切酶酶切技术琼脂糖凝胶电泳技术一、限制性内切酶酶切技术原理限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的特异序列（一般识别4－6个核苷酸序列）由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。原理本实验使用限制性内切酶（LweI），酶切位点：5′….GCATC(N)5↓…3′3′….CGTAG(N)9↑….5′正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是１个片断。器材与试剂高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等LweI限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等操作1、取样品2份（病人、正常人PCR扩增产物）无菌ddH2O14ul缓冲液10×2ul扩增产物3.5ul内切酶0.5ul2、置37oC水浴3h（或过夜）20ul混匀注意事项内切酶需在－20℃环境中保存。内切酶活性的发挥需要Mg2＋。为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。二、琼脂糖凝胶电泳技术原理溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在TAE介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。此时用紫外透射仪可以检测之。以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大小。器材与试剂紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、移液枪、枪头、塑料离心管等1％琼脂糖（含EB）、DNA样品、标准Marker、溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等操作1、制备1%凝胶板：配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60℃时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。2、制备上样样品3份（Marker、病人及正常人酶切产物）：每份样品在塑料薄膜上加：溴酚蓝溶液6×1ul样品５ul3、点样：吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。4、电泳：接通电源（80mA），约30min。5、鉴定：取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。混匀结果注意事项溴化乙啶（EB）是强诱变剂，具有高致癌性！定义：细胞培养细胞分裂指数细胞活率细胞的生长曲线细胞周期细胞培养的生命周期细胞系、细胞株细胞“代”微核系谱分析