复旦仪器分析课件03高效液相色谱法

1第十八章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography2以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等的特点。进样器高压泵色谱柱检测器数据处理器和显示器气路系统HPLCGC3GC快速、分离效率高、样品用量少。在约300万个有机化合物中，可以直接用该法分析的占20%。HPLC快速、分离效率高、样品不受挥发性及热稳定性的约束，分析对象广。与气相色谱法对比与经典液相色谱法的比较固定相颗粒细、规则均匀柱效高，分离效率高分析速度快检测灵敏度：UV10－9g，FLD10－12g4第一节高效液相色谱法的主要类型及固定相和流动相一、主要类型固定相聚集状态LLC分配、吸附、离子交换、空间排阻、……化学键合相色谱法LSC分离机制5二、HPLC的固定相对固定相的要求化学键合相将固定液的官能团键合在载体的表面构成化学键合相以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱法键合相色谱法是应用最广的色谱法6（一）化学键合相的种类和性质种类键合基团适用于非极性-C18H37、-C8H17、苯基反相弱极性O正相/反相极性CNNH2正相/反相1.种类72.键合相的性质和特点C18H37C18H37－HCl不流失、稳定，重现性好，柱效高，载样量大键合相表面的键合量（1）键合反应（2）含碳量和覆盖度（3）键合相的特点（4）注意点pH适用范围（二）其他种类固定相键合型离子交换剂手性固定相亲和色谱固定相8在硅胶为载体，用化学方法键合上各种离子交换基团广泛用于各种离子（无机离子）分析测定由各种具手性的物质组成固定相选择分析、分离对映体的最重要手段由载体+与之键合的配基组成利用亲合反应的专属性，该法已成为生化药物纯化、分析的重要手段。9三、HPLC的流动相对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。溶剂应与检测器相匹配，溶剂的截止波长样品的检测波长纯度高，粘度小。10（一）流动相对分离的影响分离度R与n、、k2的关系n-决定于色谱柱（固定相）性能、k-受溶剂系统（流动相）影响)1)(1(422kknR11AB23AB12AB12增加246810110070030010060%乙腈Time(min.)mAU40%水溶剂洗脱强度增加20001600600080%乙腈Time(min.)mAU100020%水246810InjectTime高柱效低柱效柱效增加12（二）溶剂的强度和选择性1.溶剂的极性和强度2.溶剂系统的选择性3.混合溶剂的强度可按Snyder溶剂系统中的强度因子来表示：正相：P′反相：S强度因子大时洗脱能力强分组：溶质和溶剂间作用力为分类依据13四、正相键合相色谱法固定性极性流动相极性固定相：极性键合相流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂分离对象：极性至中等极性的分子型化合物正相洗脱时，出峰顺序：极性小的组分先出峰。通过极性调节剂来改变溶剂强度14五、反相键合相色谱法流动相极性固定相极性固定相：非极性键合相流动相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱碱或缓冲盐调节流动相pH以抑制组分离解，增加保留分离对象：分子型化合物反相洗脱时，出峰顺序：极性大的组分先出峰。离子抑制色谱法离子对色谱法15反相键合相色谱法影响保留行为的主要因素（1）溶质的分子结构（2）流动相（3）固定相极性，疏水性，k，tR与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k随碳链延长，键合相疏水性，k碳链一定时，键合相浓度，k16离子抑制色谱法ISCISC—调节流动相pH值以抑制组分的离解抑制剂弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲液分离机制分析对象3.0≤pKa≤7.0的弱酸7.0≤pKa≤8.0的弱碱对于弱酸：流动相pH组分pKa，k，tR调节流动相pH，抑制组分的离解，以增加其与固定相的疏水缔合作用17六、反相离子对色谱法RP-ionpairchromatography在流动相中加入离子对试剂分离机制分析对象离子化/离子型化合物离子对试剂与被分析的离子形成中性离子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡181.离子对模型-保留机制B+H+BH+RSO3NaRSO3-+Na++BH+RSO3-固定相BH+RSO3-mBAmmmsmsBAA][A][B]AB[]B[]A[BEK流动相192.影响保留因子的因素（1）离子对试剂的种类和浓度分析酸性类/带负电荷物质季铵盐分析碱性类/带正电荷物质烷基磺酸盐或硫酸盐PIC试剂碳链，k在低于胶束浓度时，PIC试剂浓度，k（2）流动相的pH影响PIC试剂和组分的离子化20七、其他高效液相色谱法离子色谱法（ionchromatography）手性色谱法（chialchromatography）亲和色谱法（affinitychromatography）21离子交换柱电导检测器抑制型（双柱）非抑制型（单柱）（一）离子色谱法ionchromatography分析对象：正、负离子22分离柱（低交换容量）交换反应：R＋－OH－+NaX→R＋－X－+NaOH洗脱反应：R＋―X－+NaOH→R＋－OH－+NaX抑制柱（高交换容量）与组分反应：R――H＋+NaX→R――Na＋+HX与洗脱剂反应：R－―H＋+NaOH→R――Na＋+H2O离子色谱法23（二）手性色谱法分析手性化合物手性固定相手性流动相例如：环糊精CD24（三）亲和色谱法特殊固定相酶、抗原等分析对象生物大分子S-载体，m-流动相1-亲和物2-其他组分3-配基4-亲和复合物5-间隔臂25亲和色谱固定相举例2OCHSiNH3()2O2)(CHOCNHNNOHOHCH2POOOCOOOCMP（配基）可用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶等多种蛋白质的纯度分析S-载体，m-流动相1-亲和物2-其他组分3-配基4-亲和复合物5-间隔臂氨丙基硅胶（载体）间隔臂26第二节分离条件的选择H=A+B/u+Cu一、HPLC中的速率理论纵向扩散涡流扩散传质阻力固定相颗粒对板高的影响H=A+B/u+CuH=A+CuB=2DmB/u减小至忽略不计27纵向扩散涡流扩散A=2dp降低降低dp传质阻抗C=Cm+Csm固定相颗粒对板高的影响使用低粘度溶剂，如甲醇、乙腈注意：两种粘度不同的溶剂混合时的情形与dp成正比与分子在流动相中的扩散系数成反比CsmCm、28A、C（Cm＋Csm）随dp而变小dp↓板高↓柱效↑小粒度、均匀的球形化学键合相低粘度流动相，流速不宜太快柱温适当HPLC实验条件纵向扩散涡流扩散传质阻力固定相颗粒对板高的影响29二、分离条件的选择（一）正相键合相色谱法的分离条件固定性极性流动相极性固定相：流动相：分离对象：正己烷为基础溶剂氰基-含双键等氨基-甾体、糖类等极性键合相，氰基、氨基烷烃（底剂）+极性调节剂30（二）反相键合相色谱法的分离条件流动相极性固定相极性固定相：流动相：分离对象：分子型化合物甲醇-水、乙腈-水pH（缓冲溶液）C18、C831（三）反相离子对色谱法的分离条件固定相：C8、C18流动相：与试样离子电荷相反，3~10mmol/L分析酸性类物质季铵盐分析碱性类物质烷基磺酸盐或硫酸盐离子对试剂的选择流动相pH的选择有机溶剂及其浓度的选择有利于离子对的形成与一般反相HPLC相同32高效液相色谱仪33一、输液系统（一）高压输液泵输液泵的性能输液泵的种类注意事项至液相系统自溶剂瓶入口单向阀出口单向阀柱塞密封垫34等度(isocratic)洗脱在同一分析周期内流动相组成保持恒定梯度(gradient)洗脱在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成（极性、离子强度和pH值等），使所有组分都在适宜条件下获得分离。（二）梯度洗脱装置高压梯度和低压梯度35二、分离和进样系统（一）进样器充样位置(Load)进样位置(Inject)六通阀进样示意图36（二）色谱柱构造：不锈钢柱管＋固定相性能评价分析型2~4.6mm10~30cm1~2mm10~20cm制备型20~40mm10~30cm柱压、H、n、fs、k、R37三、检测系统（一）主要性能灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好和适用范围广UVFDECDELSD检测器的作用是把色谱洗脱液中组分的量转变成电信号38检测原理：Lambert-Beer特点：流动相：检测波长流动相截止波长1.固定波长2.可变波长3.二极管阵列（二）紫外检测器灵敏度高、噪音低、能用于制备只能检测有紫外吸收的物质39三维光谱-色谱图Absorbance40（三）荧光检测器检测原理F=2.3QKI0Cl特点灵敏度比紫外检测器高，只适合于能产生荧光的物质41安培检测器应用最广电导检测器常用作离子色谱的检测器伏安检测器电导检测器极谱库仑安培（四）安培检测器ECD42安培检测器检测原理特点：I=nFdNdt检测灵敏度高适合于测定具有氧化还原性质的物质43上世纪90年代出现的新型的通用型检测器检测原理：特点：通用型主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物。灵敏度较低，比UV约低一个数量级，流动相必须具有挥发性，不能含有缓冲盐。（五）蒸发光散射检测器ELSD44ELSD散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分的质量m的关系为I=kmbk、b是二个与实验条件有关的常数。取对数得：lgI=blgm+lgk光束泵自色谱柱N2蒸发室雾滴组分气溶胶喷雾蒸发检测45四、数据处理和计算机控制系统用计算机控制仪器运行，自动完成数据采集和分析，各种参数的计算。46第四节高效液相色谱分析方法一、定性分析方法色谱鉴定保留值非色谱鉴定法利用专属性化学反应对分离后收集的组分定性两谱联用化学鉴定法HPLC-MSHPLC-FTIR47二、定量分析色谱系统适用性定量方法标准曲线法外标一点法外标法内标法标准曲线法内标一点法（内标对比法）塔板数、分离度、拖尾因子和重复性48外标法标准曲线法外标一点法定量方法标准曲线法内标一点法（内标对比法）内标法Ai(Ai)s=mi(mi)sA=a+bCiisibcaAA标样标样）（iiisiisiccAAAA/)/(49主成分自身对照法—药物中杂质含量的测定不加校正因子的主成分自身对照法供试品对照品(1%供试品溶液)分别进样记录色谱图杂质峰面积主成分峰面积杂质含量计算：杂质峰面积对照品溶液主成分峰面积50主成分自身对照法—药物中杂质含量的测定加校正因子的主成分自身对照法各杂质主成分对照品测定校正因子杂质峰面积主成分峰面积分别进样记录色谱图杂质含量计算：杂质峰面积校正因子对照品溶液主成分峰面积51三、高效液相色谱法分离方法的选择