复旦仪器分析课件10平面色谱法

1第十九章平面色谱法[e-mail]2平面色谱法是在平面上进行分离的一种色谱方法操作简便，无需昂贵仪器设备历史简介20世纪40年代，纸色谱法20世纪60年代，薄层色谱法Stahl于1965年出版了《薄层色谱法》一书20世纪80年代，出现了仪器化薄层色谱法3第一节分类和原理•GC•LC•SFC柱色谱平面色谱HPCE薄层色谱纸色谱薄层电泳一、分类4二、平面色谱法参数（一）定性参数1.比移值（Rf）Rf=L/L0最佳范围0.3~0.5可用范围0.2~0.8影响因素•组分结构和性质•固定相和流动相种类和性质•展开条件等52.相对比移值（Rr）Rr=Rf(i)/Rf(s)=Li/Ls纯物质加入试样中或试样中某已知组分同样条件下测定sis＋iLiLs在一定程度上消除系统误差具较高的重现性和可比性定性参数6（二）相平衡参数1.分配系数（K）和保留因子（k）2.相互关系kR11'kRf11ffRRk1msfKRVV11msmmssKcckVVVVffRRk17•当Vs/Vm固定时，Rf由K决定•K不等是分离的前提•当实验条件固定时，K只与组分性质有关msfKRVV11msmmssKcckVVVV•Rf为1的组分，K(k)=0，表示该组分不被固定相保留•Rf为0的组分，K(k)=，表示该组分完全被固定相所保留（停留在原点）ffRRk18（三）分离参数1.分离度（resolutionR）R2dW1+W2=在平面色谱法中：R19第二节薄层色谱法（thinlayerchromatography;TLC）TLC的特点分离能力较强，结果直观分析速度快，min试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制上样量较大所用仪器简单，操作方便10一、薄层色谱法的主要类型•吸附薄层色谱法•分配薄层色谱法固定相为液体（吸附于载体上）固定相为吸附剂一般极性大的组分移动速度慢固定相展开剂正相含水硅胶弱极性有机溶剂反相烷基化化学键合相水-有机溶剂11（三）高效薄层法（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC）•在现代色谱理论指导下，以经典薄层色谱法为基础发展起来的一种薄层色谱技术。•特点分离效率高分析速度快检测灵敏度高等高效薄层色谱法与经典薄层色谱法比较见表19-312二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂（一）吸附剂•吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂•常用的吸附剂有硅胶、硅藻土、氧化铝、纤维素、聚酰胺薄膜等•一般要求粒径为5～40m131.硅胶•表面带有硅醇基呈弱酸性，与极性基团形成氢键而表现其吸附性能，不同组分的极性基团因与硅醇基形成氢键的能力不同而被分离。•吸附能力SiO2·xH2OSiO2105℃～110℃含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，Rf值越大与分离效率有关的因素：•粒度和孔径硅胶粒度，均匀性越好，分离效率•表面积硅胶表面积，则与样品之间的相互作用14氧化铝和硅胶含水量与活性的比较硅胶含水量%活性级氧化铝含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15152.氧化铝碱性、中性和酸性。活性也与含水量有关，含水量越高，活性越低。3.聚酰胺酰胺基可与酚、羧酸、氨基酸等形成氢键，对这类物质有高的选择性。16商品出售的薄层色谱用氧化铝和硅胶有氧化铝（硅胶）G，表示含有粘合剂煅石膏氧化铝（硅胶）H，表示不含有粘合剂氧化铝（硅胶）HF254，表示不含粘合剂而含有荧光物质；在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景17（二）展开剂展开剂的选择根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开剂的极性三者的相对关系进行选择先用单一溶剂展开，然后根据分离效果进行调整，经常使用混合展开剂分离酸碱组分时，展开中加入少量酸、碱常用混合展开剂表19-318化合物极性、吸附剂活度和展开剂极性间的关系ABCA’B’C’(2)吸附剂(3)展开剂活泼不活泼极性非极性极性非极性(1)被分离物质19三、薄层色谱操作方法涂布不加粘合剂加粘合剂如5~15%石膏或0.25~0.75%CMC-Na活化活化涂布晾干干燥器中备用（一）薄层板的制板选择5cm20cm、10cm20cm、20cm20cm0.2～0.3mm1100C，30min20（二）点样•配样溶剂的选择•点样量取决于待分析化合物的类型和特性，相似相溶合适的样品浓度应为0.01%~0.1%影响展开后样品的形状点样量一般为几微升考虑灵敏度21（三）展开•器皿•方式•防止边缘效应使用的器皿一般为长方形密闭玻璃缸，称为层析缸或色谱缸。常用上行法，另外还有下行法、径向展开、多次展开。产生原因层析缸蒸气饱和22（四）斑点的定位1.有色物质2.有紫外吸收/荧光3.无色物质普通板，荧光板通用型碘、硫酸、荧光黄等专用型某个或某一类官能团日光下观察紫外灯下观察喷洒显色剂23四、定性和定量分析（一）定性分析（二）杂质检查RfRr1.杂质对照品比较法2.主成分自身对照法241.与对照品比较杂质对照品供试品配制一定浓度的供试品溶液稀释至低浓度作为对照品溶液2.主成分自身对照法25（三）定量方法洗脱法直接定量法目视比色法薄层扫描法26五、薄层扫描法简介•用一定波长的光束照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸光度A（或荧光强度F）随展开距离l的变化，所记录的A～l（或F～l）曲线称为薄层色谱扫描图，利用薄层扫描图进行定量及定性分析的方法成为薄层扫描法271.测定波长的选择•常采用双波长法测量值：sR由于从测量值中减去了薄层本身的空白吸收，所以在一定程度上消除了薄层不均匀的影响，使测定结果准确度提高。282.薄层扫描法（1）透射法（2）反射法0lgTTA0lgRRAT0＝i0I0T＝iI0R0＝j0I0R＝jI029扫描方法•线形扫描快速，但在斑点不规则和浓度不均匀时测量误差较大•曲折形扫描适用于形状不规则及浓度分布不均匀的斑点303.散射参数的选择由于吸光度与斑点中组分的量不遵守比耳定律，故校正曲线成弯曲状，需要将其校正为直线。曲线校正是将散射参数和处理方法存入计算机，计算机根据适当的修正程序，自动进行校正给出符合一定线性关系的数值，从而得到一定线性的定量工作曲线。4.荧光法测定315.定量分析方法样样bAam2121AAmmb11bAma外标一点法外标两点法32第三节纸色谱法（paperchromatography）一、分离原理以纸为载体的平面色谱法。其分离原理属于分配色谱的范畴。与薄层色谱相同，纸色谱也常用比移值Rf来表示各组分在色谱中位置。K与化合物的分子结构及流动相种类和极性有关•当流动相一定时，化合物的极性越大或亲水性越强，K越大，Rf值越小；反之亦然。•当化合物一定时，流动相极性越大，K越小，Rf值越大。33三种六碳糖的Rf值六碳糖羟基数目溶剂系统正丁醇-水Rf正丁醇-酸-水(4:1:5)Rf乙酸乙酯-吡啶-水(25:10:35)Rf葡萄糖50.030.170.10鼠李唐40.270.420.44洋地黄毒糖30.580.660.8834二、纸色谱法的实验条件•色谱纸的选择•固定相•展开剂的选择•操作步骤纸质，型号（快、中、慢），厚薄等一般为水，也可以是DMF或缓冲溶液水饱和的有机溶剂等参照TLC35主要色谱类型色谱类型分离原理载体固定相展开剂Rf值顺序吸附薄层吸附硅胶有机溶剂极性小的Rf值大正相薄层分配硅胶水有机溶剂极性小的Rf值大反相薄层分配硅胶硅胶键合相水—有机溶剂极性小的Rf值小纸色谱分配纸纤维水水—有机溶剂极性小的Rf值大