复旦仪器分析课件12荧光分析法

第十一章荧光分析法fluorometry1概述2方法特点灵敏度高选择性好分类分子荧光原子荧光紫外荧光X射线荧光红外荧光第一节基本原理一、分子荧光（一）分子荧光的产生1．分子的电子能级与激发过程3S0S1*T1*电子能级的多重性M＝2s＋1Ehc2.荧光的产生基态•Boltzmann分布，分子在室温时基本上处于电子能级的基态激发•当吸收光辐射时，分子被激发而跃迁至较高的电子能态（激发态）去激•处于激发态的分子是不稳定的，通过多种途径释放出能量而返回基态45吸收荧光磷光6吸收振动驰豫荧光内转换外转换磷光体系间跨越•振动弛豫•内部能量转换•荧光发射fluorometry•外部能量转换•体系间跨越•磷光发射7同一电子能级S2*S1*基态的任一振动能级S0(Vn)第一电子激发态的最低振动能级S1*(V0)S1*/T1*S0S1*T1*T1*(V0)S0(Vn)（二）激发光谱与发射光谱8激发光谱横坐标ex，纵坐标发射光强度荧光光谱横坐标em，纵坐标发射光强度荧光强度(nm)400300光源单色器单色器2检测器1荧光强度(nm)400500溶液荧光光谱通常具有如下特征斯托克斯位移荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系91.斯托克斯位移emex10=-’3604802.荧光光谱的形状与激发波长无关11荧光强度(nm)360320480S1*(V0)S0(Vn)蒽的激发光谱和发射光谱12荧光强度nm250350V=01234S0S1*123403.荧光光谱形状与激发光谱的镜像关系二、荧光与分子结构的关系（一）荧光寿命和荧光效率13lnF0FttKtteFF0tFFtf01ln荧光寿命f当除去激光光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间fK114f=发射荧光的光子数吸收激发光的光子数一般物质f0~1之间荧光效率f激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比（二）有机化合物分子结构与荧光的关系15发射荧光具备的两个条件：1.强的可见紫外吸收2.一定的荧光效率•长共轭结构•刚性和共平面性•取代基1.长共轭结构•芳香族化合物，共轭越长，ex和em都长移，荧光效率也提高。16ex=205nmem=278nmex=286nmem=321nmex=356nmem=404nmf=0.11f=0.36f=0.29•长共轭的脂肪烃也可能有荧光但为数不多2.分子的刚性•同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子增加了共平面性，越大，长移。17f=0.2f=1.0荧光素钠CH2OCOO-O-OOCOO--O原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉18Mg原来共平面性较好的1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐SO3NaNCH3CH3SO3NaHNCH3CH3NOHNOMg1/23.取代基19第一类：使电子的共轭程度，，em如：-NH2、-OH、-OCH3OHO-第二类：使电子的共轭程度，使如：-COOH、-NO2、NHCOCH3第三类：影响较小如：-R、-SO3H等20（三）荧光试剂重要的荧光试剂•荧光胺•邻苯二甲醛(OPA)•Dansyl-Cl•测定无机离子的荧光试剂21试剂被测物产物（荧光）荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应22（-NH2）R-NH2ex275,390nmem480nmOOOOOHNOHCOOH+邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应23+RNH2+HSCH2CH2OH+2H2OpH9~10OH-ex340nmem~455nmCHOCHON-RSCH2CH2OHDansyl-Cl与伯仲胺及酚羟基反应24+RNH2无水丙酮+HClex365nmem~500nmNH3CCH3SO2ClNH3CCH3SO2NHR25ex370nmem580nm测定无机离子NOH+Li+NOLi产生荧光例如：铝的测定ex390nmem510nm26测定无机离子使荧光熄灭+AlCN-F-荧光熄灭或减弱NOAl1/3NOH荧光熄灭法三、影响荧光强度的外部因素使K带吸收长移，跃迁几率增大，荧光波长长移，强度增加。272.溶剂1.温度温度升高荧光效率下降极性粘度溶剂粘度降低，荧光强度减弱。3.酸度（pH值）28其他物质荧光物质4.荧光熄灭剂29荧光熄灭法荧光自熄灭C1g/l配合物，不发荧光体系间跨越不发荧光发生碰撞失去能量物质本身5.散射光30光子与物质分子碰撞弹性碰撞非弹性碰撞碰撞双方能量不变光子运动方向改变碰撞过程中发生能量传递，同时光子运动方向发生改变Reyleighscatteringlight与入射光波长相同Ramanscatteringlight与入射光波长不同例：硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光谱31强度nm320350360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmnm不同ex时的瑞利散射和拉曼散射32强度nm320448350448360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmem448nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmem448nm对测定无影响对测定有影响例：硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光谱不同ex时的拉曼散射对荧光的影响溶剂激发光（nm）248313365405436水271350416469511乙醇267344409459500环己烷267344408458499CCl4——320375418450CHCl3——34641046150233在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长散射光（拉曼）对荧光测定有影响选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰第二节荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系34I0IFF=K’(I0-I)I=I010-EcLF=K’I0(1-10-EcL)=K’I0(1-e-2.3EcL)F=K’I0(1-10-EcL)=K’I0(1-e-2.3EcL)35若c很小，Ecl≤0.0523(2.3)(2.3)(2.3))]1!2!3!EclEclEcl23(2.3)(2.3)]2!3!EclEclF=K'I0[1－(1+=K'I0[2.3Ecl－F=2.3K’I0Ecl=KcEcl≤0.05FcEcl0.05F与c不成正比•荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法36荧光法紫外法0lglgIITAF=Kc二、定量分析方法1.工作曲线法37c1c2c3c4c5100%2060804080%16486432cxF用空白溶液调零用标准溶液调满刻度2.比例法（对比法）•若在某浓度范围内成线性，可用比例法测定3800FFFFccxsxsssxxcFFFFc00cxF3.联立方程式法（多组分分析）•各组分荧光峰不重叠，可分别测定•相互重叠，可利用荧光强度的加和性39ba12Fa=KaCa+KbCb1:Fa’=Ka’Ca+Kb’Cb2:光源单色器样品池单色器检测器信号处理和输出第三节仪器与其他荧光分析技术40一、荧光分光光度计1.主要部件氙灯滤光片单色器光电倍增管2.仪器的校正灵敏度波长激发光谱和荧光光谱41以能被检出的最低信号来表示在选定条件下用稳定荧光物质校正用汞灯标准谱线校正双光束仪器时，误差可抵消二、其他荧光分析技术简介激光诱导荧光分析时间分辨荧光同步荧光分析仪器方面更新胶束增敏荧光分析化学方法改善42431.激光诱导荧光分析光源激光单色器单色器2检测器1灵敏度10-14~10-16g以激光作光源，谱线更纯、强度更大2.时间分辨荧光44消除干扰，提高选择性、灵敏度脉冲激光样品干扰组分利用物质荧光发射的时间差3.同步荧光分析45若：=em-exFsp=KcFemFex混合物的同步荧光光谱（=3nm）提高灵敏度和选择性固定，同时扫描激光光谱和发射光谱4.胶束增敏荧光46CH3(CH2)11OSO3-Na+非极性疏水基团极性亲水基团增加溶解度增加荧光效率增加荧光的稳定性