复旦仪器分析实验课件13高效毛细管电泳

成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切高效毛细管电泳高效毛细管电泳CapillaryElectrophoresis复旦大学化学教学实验中心雷雷杰杰成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切一、电一、电泳泳((eletrophoresiseletrophoresis))：：带电粒子在电场中的定向移动。带电粒子在电场中的定向移动。•1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯（Tiselius）设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔化学奖。多年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。•各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切蒂塞利乌斯ArneWilhelmKaurinTiselius（1902-1971）1902年8月10日生于斯德哥尔摩,1971年10月29日卒于同地。他4岁时随家移居哥德堡。1921年入乌普萨拉大学,就读于物理化学家T.斯韦德贝里。1924年获化学、物理和数学三个硕士学位,1930年获博士学位。后任乌普萨拉大学化学讲师、副教授。在此期间曾先后两次赴美国威斯康星大学和普林斯顿大学从事研究和进修,1938年任教授。蒂塞利乌斯1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与斯韦德贝里合作发表了第一篇论文,报导了测定蛋白质淌度的新方法。1930年他进一步改进实验手段和装置,发表了关于色谱法和吸附的论文。1935年从美国回国后,重新改建原有电泳装置,发展了区带电泳法,大大提高了效率和分辨率。1940年他用自已设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分,分别命名为:白蛋白、α、β、和γ球蛋白。该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。他因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切二、毛细管电泳二、毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis)(CapillaryElectrophoresis)•毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。•采用了0.05mm内径的毛细管；•采用了高达数千伏的电压。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切（一）基本概念毛细管有效长度(l,cm)毛细管的入口端到检测窗口的距离；迁移时间(t,min)带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；电泳速度（vcm/s）在单位时间内，带电粒子定向移动的距离；电场强度(E,V/cm)电场强度/毛细管总长度；电泳淌度（μcm2/(V·s)）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；三、毛细管电泳基本原理三、毛细管电泳基本原理毛细管总长度(L,cm)成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切毛细管(内径50μm,外径375μm)毛细管全长（L）入口到检测窗总长（l）成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切当固体与液体接触时，固体表面带一种电荷，因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。（二）电渗现象与电渗流（electroosmosisandelectroosmoticflow）成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切毛细管电泳中，溶液整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动，谱带展宽很小；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍，引起谱带展宽较大。石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层后，电渗流方向为由正极到负极。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO+-Na+Cl-电渗电泳电泳迁移速度Na+Cl-矢量速度合速度成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；（三）影响电渗流的因素2.毛细管材料的影响1.电场强度的影响成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。3.电解质溶液性质的影响成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；4.温度的影响成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂可控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流减小。5.添加剂的影响成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切色谱过程热力学DetectorResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)t=保留时间t=死时间RW=峰底宽度0tR(B)-tR(A)WA+WBR=2tR(B)-tR(A)W1/2A+W1/2B=1.176K’=tR-t0t0容量因子分离度－定性和定量：保留时间和峰面积（峰高）（四）色谱参数成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切色谱过程动力学之塔板理论塔板高度H＝L/n2R2R)(16)(16bbWtWVn==理论塔板数tR为样品的保留时间；Wb为峰底宽；tR‘为调整保留时间；L色谱柱长度。成人与