复旦仪器分析实验课件16分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素

实验实验实验14  14  14  分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素（维生素（维生素（维生素B2B2B2）））18:08:3418:08:3418:08:34复旦化学系教学实验中心一、实验目的二、方法原理三、FL-4500荧光分光光度计四、实验步骤五、数据处理六、思考题18:08:3418:08:3418:08:34一、实验目的18:08:3418:08:3418:08:341.掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强度的影响。2.了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。3.掌握荧光分析法基本原理和实验方法。二、方法原理18:08:3418:08:3418:08:341.荧光、荧光分子/荧光物质2.荧光分析法：特点、定量方法3.荧光分光光度计：结构、原理、操作4.核黄素VB2：结构、性质、面粉中提取方法18:08:3418:08:3418:08:34分子发光的基本原理分子发光的基本原理™™第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家N.MonardesN.Monardes，，15751575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为““LignumLignumNephriticumNephriticum””的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。色。™™直到直到18521852年，年，StokesStokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石念，他还由发荧光的矿石““萤石萤石””推演而提出推演而提出““荧光荧光””这一术语。这一术语。™™18671867年，年，GoppelsroderGoppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝应用铝——桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。™™1919世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到19281928年，才由年，才由JetteJette和和WestWest提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。18:08:3418:08:3418:08:34分子发光的类型分子发光的类型按激发的模式分按激发的模式分类：类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类：光致发光光致发光化学发光化学发光//生物发光生物发光热致发光热致发光场致发光场致发光摩擦发光摩擦发光荧光荧光磷光磷光瞬时荧光瞬时荧光迟滞荧光迟滞荧光按光子能量分类：按光子能量分类：斯托克斯荧光斯托克斯荧光(Stokes)(Stokes)：：λλexexλλemem反斯托克斯荧光反斯托克斯荧光(Antistokes)(Antistokes)：：λλexexλλemem共振荧光共振荧光(R)(R)λλ荧光荧光18:08:3418:08:3418:08:34荧光产生的机制荧光产生的机制——分子的活化与去活化过程18:08:3418:08:3418:08:34分子荧光分子荧光((磷光磷光))光谱光谱1.1.荧光荧光((磷光磷光))激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱荧光荧光((磷光磷光))均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。同波长的荧光。A.A.激发光谱激发光谱20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFλ固定固定λλemem=620nm(MAX)=620nm(MAX)λλexex=290nm=290nm(MAX)(MAX)固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长*MXMX⇒+∑=n1iihv∑=+⇒n1jjhvMXMX*18:08:3418:08:3418:08:34B.B.发射光谱发射光谱((荧光光谱荧光光谱))固定激发波长固定激发波长扫描发射波长扫描发射波长C.C.激发光谱与发射激发光谱与发射光谱的镜像关系光谱的镜像关系SS0044332211SS1144332211发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：分子被激发到分子被激发到SS11或者高于或者高于SS11的电子态，经过极快的内转换和振动弛豫的电子态，经过极快的内转换和振动弛豫降到降到SS11电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。态。20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFλλλexex=290nm=290nm(MAX)(MAX)固定固定λλemem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定λλexex=290nm=290nm(MAX)(MAX)λλemem==620nm620nm(MAX)(MAX)11→→4411→→3311→→2211→→1111→→1111→→2211→→3311→→4418:08:3418:08:3418:08:34三维荧光光谱的两种表示（b）等高线光谱图（a）等角三维投影图分子荧光光度法的一些基本概念z激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途？结构特点：π→π﹡、共轭π体系、刚性平面结构、取代基18:08:3418:08:3418:08:34如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素在溶液中有很强的荧光，而酚酞没有。如芴和联苯在相同的条件下，荧光量子产率约为1和0.18强荧光物质强荧光物质影响荧光发射溶液环境因素：（a）溶剂效应：取决于荧光体和溶剂的化学结构、极性、重原子效应（b）温度：T↑φf↓（c）pH平衡解离关系对λf.max、φf均有影响18:08:3418:08:3418:08:34溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭）引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂。bC303.20teT,bCIIlgTlgAεε−==−=−=光吸收定律光吸收定律（（LambertLambert––BeerLawBeerLaw））bCε303.20te1T1II1−−=−=−相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：)e1(IIIbCε303.20t0−−=−荧光强度（荧光强度（IIFF）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：)e1(I)II(IbCε303.20t0F−−=−=φφ按照级数展开式：按照级数展开式：!nx!4x!3x!2x!1x1en432x+•••+++++=荧光定量分析基础荧光定量分析基础————荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系)!4)bCε30.2(!3)bCε30.2(!2)bCε30.2(bCε30.2(II4320F⋅⋅⋅⋅⋅⋅+−−−+−−=φ对于稀溶液，当对于稀溶液，当εεbcbc0.0.0505（（磷光磷光εεbcbc0.0.0101）时：）时：CbεIk30.2I0FFφ=IIFF--------荧光强度荧光强度φφFF----------荧光量子产率荧光量子产率kk----与仪器灵敏度有关的参数与仪器灵敏度有关的参数II00----入射光强度。入射光强度。CbεIk30.2I0PPφ=IIPP--------磷光强度磷光强度φφPP----------磷光磷光量子产率量子产率bb----吸收光程吸收光程εε----摩尔吸光系数摩尔吸光系数CC----荧光物质浓度荧光物质浓度荧光定量分析基础荧光定量分析基础————荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系18:08:3418:08:3418:08:34荧光强度IF与荧光物质的溶液浓度c成线性关系IF=2.3ϕFI0εbcIF=2.3ϕFI0εbcb—试样的吸收光程ε—摩尔吸光系数ϕF—荧光发射的量子产率IF—荧光强度当I0及b一定稀溶液中c—试样浓度IF=kcIF=kcI0—入射光强度荧光定量分析基础荧光定量分析基础————荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系18:08:3418:08:3418:08:34荧光荧光((磷光磷光))的量子产率的量子产率荧光量子产率的定义：荧光量子产率的定义：激发分子总数发射荧光的分子数=Fφ∑=+=n1iiFFFkkkφkkFF、、kkpp主要取决与荧光物质的分子结构；主要取决与荧光物质的分子结构；φφstst系间窜跃效率。系间窜跃效率。ΣΣkkii主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数的荧光物质的量子产率在大多数的荧光物质的量子产率在0.1~10.1~1之间；之间；例如：例如：0.05mol/L0.05mol/L的硫酸喹啉，的硫酸喹啉，φφFF=0.55=0.55；；荧光素荧光素φφFF==11化合物化合物φφFF0.110.110.290.290.460.460.600.600.520.52激发分子总数发射磷光的分子数=Pφ∑=+=n1iiPPstPkkkφφ18:08:3418:08:3418:08:34标准曲线法（工作曲线法）标准曲线法（工作曲线法）1.最大激发波长、最大吸收波长的选择；2.系列标准溶液绘制工作曲线；3.测定未知溶液，查得其浓度。标准曲线法求解K：（1）图解法（2）解析法•灵敏度高：测定下限在0.1~0.001μg/mL，比分光光度法高2~4个数量级。光强I与I0的信号差别～荧光发射的光强•选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛，干扰物质较少18:08:3418:08:3418:08:34分子荧光分光光度法分子荧光分光光度法v.s.v.s.紫外紫外--可见分光光度法可见分光光度法三、F‐4500型荧光分光光度计18:08:3418:08:3418:08:34荧光分光光度计荧光分光光度计主要组成及部件的主要组成及部件的荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源光源氙氙灯灯激发单色器激发单色器样品池样品池光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理仪器控制仪器控制光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器发射单色器发射单色器问题：问题：荧光分光光度荧光分光光度计与紫外计与紫外--可见分光光可见分光光度计有何异同点？度计有何异同点？18:08:3418:08:3418:08:34比色皿：？样品槽：三、三、三、FFF‐‐‐450045004500型荧光分光光度计型荧光分光光度计型荧光分光光度计18:08:3418:08:3418:08:34FFF---450045004500型荧光分光光度计光路图型荧光分光光度计光路图型荧光分光光度计光路图18:08:3418:08:3418:08:341、开机Power-Xelamp-Main启动软件FLSolutionsProgramF-4500型荧光分光光度计的使用18:08:3418:08:3418:08:342、波长扫描wavelength??ScanStart—Method—Sample—Pre-scan—Measure—数据处理—ReportMethod:F-4500型荧光分光光度计的使用18:08:3418