华北理工药物分析课件16抗生素类药物的分析

第十六章抗生素类药物的分析学习要求1.掌握：抗生素类药物的类型、结构、质量和稳定性特点、以及分析方法。2.熟悉：各类抗生素药物的有关物质来源、特点和检查方法。3.了解：抗生素药物的体内样品分析方法和临床监测应用。第一节概述第二节β-内酰胺类抗生素第三节氨基糖苷类抗生素第四节四环素类抗生素第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查抗生素(Antibiotics)类药物是临床上常用的一类重要药物，临床使用的抗生素的主要是生物合成，经过发酵和提纯两步制得；也有少数是利用化学合成或半合成方法制得。ChP2010共收载抗生素类原料药及其各种制剂近300个品种。一、抗生素类药物的定义和特点青霉素于1929年被Flemmimg发现，至1943年链霉素的发现者赛尔曼•瓦克斯曼才给出了抗生素的定义，即微生物代谢产生的能抑制它种微生物生长活动甚至杀灭它种微生物的化学物质。一般认为，比较确切的抗生素的定义应为：抗生素是生物(包括微生物、植物、动物)在其生命活动中产生的(或并用化学、生物或生化方法衍生的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。第一节概述与化学合成药物相比，其结构、组成更复杂，表现为：1.化学纯度较低有三多：即同系物多，如庆大霉素、新霉素、等含有多个组分；异构体多，半合成-内酰胺抗生素、氨基糖苷类抗生素具有旋光性，均存在光学异构体，如药用巴龙霉素为两个立体异构体巴龙霉素I和巴龙霉素II的混合物；降解物多，如四环素类存在脱水、差向异构体。2.活性组分易发生变异微生物菌株的变化、发酵条件改变等均可导致产品质量发生变化，如组分的组成或比例的改变。3.稳定性差抗生素分子结构中通常含有活泼基团，而这些基团往往是抗生素的活性中心，如青霉素、头孢菌素类结构中的-内酰胺环，链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点。二、抗生素类药物的分类1.根据产生抗生素的生物来源分类细菌产生的抗生素、真菌产生的抗生素、放线菌产生的抗生素、高等植物产生的抗生素、动物产生的抗生素；2.根据抗生素的作用对象分类抗革兰氏阳性菌的抗生素、抗革兰氏阴性菌的抗生素、广谱抗生素、抗真菌的抗生素、抗肿瘤的抗生素、抗病毒及抗原虫系昆虫的抗生素、抗结核分枝杆菌的抗生素；3.根据抗生素的作用机制分类抑制细胞壁合成的抗生素、影响细胞膜功能的抗生素、抑制和干扰细胞蛋白质合成的抗生素、抑制细胞核酸合成的抗生素、抑制细菌生物能作用的抗生素；4.根据抗生素的化学结构分类其中以作用对象、化学结构不同进行分类是较常用的，前者对于临床选用抗生素带来一定方便，后者有利于抗生素工业生产和质量分析研究。按照化学结构分类共分为以下九大类。根据抗生素的化学结构分类(1)β-内酰胺类抗生素(2)四环类抗生素(3)氨基糖苷类抗生素(4)大环内酯类抗生素(5)多烯大环类抗生素(6)多肽类抗生素(7)酰胺醇类抗生素(8)抗肿瘤类抗生素(9)其它抗生素主要讨论β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类抗生素的物理化学性质、鉴别反应、杂质检查、含量测定方法与原理。关于生物学方法(如异常毒性、热原、降压物质、无菌、生物效价测定法等)，根据专业要求，在此不赘述(需要进一步了解，参考ChP2010二部附录Ⅺ)。三、抗生素类药物的细菌耐药性在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的微生物，统称耐药菌。所谓细菌耐药性(bacterialresistance)又称抗药性，是指细菌产生的对抗菌药不敏感的现象，是细菌自身生存过程的一种特殊表现形式。1.耐药性的种类2.耐药的机制四、抗生素药物的质量分析抗生素类药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量(效价)测定三个主要方面来判断其质量的优劣。由于抗生素类药物的特点，其分析方法可分为理化方法和生物学法两大类。(一)鉴别试验抗生素类药物鉴别试验主要为理化方法，常用方法有：1.官能团的显色反应如-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应。对于抗生素盐类，通常鉴别酸根或金属离子或有机碱。2.光谱法包括红外光谱与紫外吸收光谱的鉴别。抗生素的红外光谱分析时需注意，由于抗生素存在多晶现象，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照品，使处于相同晶型情况下再进行测定，若多晶效应是由于研磨和压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法试验。3.色谱法包括TLC和HPLC法，采用对照品或标准品对照法。4.生物学法是检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别，此法已很少应用。(一)鉴别试验(二)检查抗生素类药物的检查项目包括：1.影响产品稳定性的检查项目结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等；2.控制有机和无机杂质的检查项目溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；3.与临床安全性密切相关的检查项目异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等；4.其他检查项目对于多组分抗生素还要进行组分分析等(如硫酸庆大霉素的“庆大霉素C组分的测定”)。此外，有些抗生素还规定“悬浮时间与抽针试验”(如注射用普鲁卡因青霉素)、“聚合物”(如-内酰胺类抗生素)、“杂质吸光度”(如四环素类抗生素)等。(三)含量或效价测定1.微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性(效价)的方法。测定方法可分为管碟法和浊度法：管碟法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。浊度法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。微生物检定法的优点是灵敏度高、需用量小，测定结果较直观；测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且适用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价，是抗生素药物效价测定的最基本的方法。但其存在着操作步骤多，测定时间长，误差大等缺点，随着抗生素类药物的发展和分析方法的进步，理化方法逐渐取代了生物学法，但对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法仍然是首选的效价测定方法。2.理化方法是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性。但本法也存在不足：如化学法通常是利用抗生素化学结构上官能团的特殊化学反应，对含有具同样官能团杂质的供试品就不适用，或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。因此，通常在以理化方法测定抗生素含量时，不但要求方法正确可靠、具有专属性、操作简单、省时、试剂易得、样品用量少，而且要求测定结果必须与生物效价吻合。目前世界各国药典所收载的抗生素的理化方法主要是HPLC法，如-内酰胺类、四环素类、大环内酯类等抗生素大多采用HPLC法测定含量。3.抗生素活性表示方法抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价用单位(U)或微克(g)表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定如：1mg青霉素钠定为1670U；1mg庆大霉素定为590U；1mg硫酸卡那霉素定为670U。一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。例：1mg青霉素钾的单位(U)=1670×356.4/372.5=1598U/mg。以上为抗生素的理论效价，实际样品往往低于该理论效价。第二节β-内酰胺类抗生素本类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类，它们的分子结构中均含有β-内酰胺环，因此统称为β-内酰胺类抗生素。发展史1929年，弗来明(AlexanderFleming)发现青霉素。1958年谢汉合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)成功。开创了半合成青霉素的时代1961年，头孢菌素C被发现，头孢菌素迅速发展。80年代:广谱碳青霉烯类上市。一、化学结构与性质青霉素类的基本结构头孢菌素的基本结构1.化学结构：β-内酰胺环侧链A：-内酰胺环B：氢化噻唑环青霉素类（penicillins）NSHHNHOHCH3CH3OOHOR1234567侧链A：-内酰胺环B：氢化噻嗪环头孢菌素类（cephalosporins）SNOHHOHR1ONROHAB54321768AB6-APA7-ACA药物名称物理性质鉴别检查含量测定阿莫西林Amoxicillin白色或类白色结晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在乙醇中几乎不溶。[]D(水溶液)+290o～+315o。1.TLC或HPLC2.IR1.有关物质：HPLC；2.阿莫西林聚合物；3.残留溶剂：丙酮与二氯甲烷；4.水分HPLC法阿莫西林钠AmoxicillinSodium白色或类白色粉末或结晶；无臭或微臭，味微苦；有引湿性。在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。[]D(水溶液)+240o～+290o。1.TLC或HPLC2.IR3.钠盐的鉴别1.有关物质：HPLC；2.残留溶剂：乙醇与乙酸甲酯；3.2-乙基己酸；4.水分；5.可见异物；6.不溶性微粒；7.细菌内毒素；8.无菌HPLC法青霉素Ⅴ钾PhenoxymethylpenicillinPotassium白色结晶或结晶性粉末；无臭或微臭，微苦。在水中易溶，在三氯甲烷、乙醚或液体石蜡中几乎不溶。[]D(水溶液)+215o～+230o。1.HPLC2.IR3.钾盐的鉴别1.吸光度；2.结晶性；3.有关物质：HPLC；4.青霉素Ⅴ聚合物；5.水分HPLC法青霉素钠BenzylpenicillinSodium白色结晶性粉末；无臭或微有特异性臭；有引湿性；遇酸、碱或氧化剂等即迅速失效，水溶液在室温放置易失效。在水中极易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。1.HPLC2.IR3.钠盐的鉴别1.吸光度；2.结晶性；3.有关物质：HPLC；4.青霉素聚合物；5.可见异物；6.不溶性微粒；7.细菌内毒素；8.无菌HPLC法氨苄西林Ampicillin白色结晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在三氯甲烷、乙醇、乙醚或不挥发油中不溶；在稀酸溶液或稀碱溶液中溶解。[]D(水溶液)+280o～+305o。1.TLC或HPLC2.IR1.有关物质：HPLC；2.N,N-二甲基苯胺：GC；3.水分HPLC法普鲁卡因青霉素ProcaineBenzylpenicillin白色微晶性粉末；遇酸、碱或氧化剂等即迅速失效。在甲醇中易溶，在乙醇或三氯甲烷中略溶，在水中微溶。[]D(水溶液)+280o～+305o。1.TLC或HPLC2.IR1.有关物质：HPLC；2.青霉素聚合物；3.残留溶剂：乙酸乙酯与正丁醇；4.水分；5.细菌内毒素；6.无菌HPLC法β-内酰胺类抗生素部分原料药的物理性质、鉴别、检查和含量测定β-内酰胺类抗生素部分原料药的物理性质、鉴别、检查和含量测定药物名称物理性质鉴别检查含量测定头孢他啶Ceftazidime白色或类白色结晶性粉末；无臭或微有特臭。在磷酸盐缓冲液(pH6.0)中略溶，在水或甲醇中微溶，在丙酮或三氯甲烷中不溶。E1%1cm(磷酸盐缓冲液pH6.0)400～430。1.HPLC2.IR1.有关物质：HPLC；2.头孢他啶聚合物；3.吡啶：HPLC；4.可见异物；5.不溶性微粒；6.细菌内毒素；7.无菌HPLC法头孢克洛Cefaclor白色至微黄色粉末或结晶性粉末，微臭。在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中几乎不溶。[]D(水溶液)+105o～+120o。E1%1cm(水溶液)230～255。1.TLC或HPLC2.IR1.有关物质：HPLC；2.残留溶剂：二氯甲烷；3.水分HPLC法头孢呋辛酯