华北理工水处理生物学实验指导05培养基的制备及灭菌

实验五培养基的制备及灭菌本次实验可为下次实验作准备。实验内容主要包括玻璃器皿的洗刷、包装和培养基的制备以及灭菌技术等。在进行微生物学实验时，所用培养基及玻璃器皿等均须进行灭菌。一、目的1．学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2．掌握培养基配制和无菌水制备的方法。3．学会高压蒸汽灭菌技术。二、实验器材1．培养皿(又称平皿，直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯等。2．纱布、棉花、报纸、牛皮纸。3．pH试纸6—8.4(或pH电位计或氢离子浓度比色计)、洗液、10％HCL、10％NaOH。4．牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。5．高压蒸气灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。三、实验内容(一)玻璃器皿的洗刷与包装1．洗刷玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管则先用洗液浸泡、再用水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱中烘干。2．包装(1)培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。(2)吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1一1.5cm长的棉塞，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管的尖端，放在4—5cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成45°交角，折叠包装纸包住尖端(图8—8)，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即螺旋式地包在管子外面，余下纸头折叠打结，按照实验需要，可单支包装或多支包装，以备灭菌。培养皿和吸管也有放在特制容器内进行灭菌的。(3)试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花塞堵塞。做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入。棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2／3应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。棉塞的大小及形状应如图8—9所示。在制作培养基的过程中，如不慎将棉塞沾上培养基时，应用清洁棉花重做。待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内（用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞)，以备灭菌。(二)培养基的制备1．步骤(1)配制溶液按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶的原料如蛋白陈、肉膏、琼脂等需加热溶解，这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。(2)调整pH值用pH试纸(或pH电位计或氢离子浓度比色计)测定培养基溶液的pH值。(3)过滤用沙布、滤纸或棉花过滤均可。如培养基内杂质很少，可省略过滤。(4)分装将培养基分装在试管和锥形瓶内。要使培养基直接流入管内或瓶内，注意防止沾污上段管壁或瓶壁，并避免浸湿棉塞。装入试管或锥形瓶的培养基量，视试管或瓶子的大小及需要而定。一般制备斜面培养基时，每支试管装入的量约为试管高度的1／4—1／3。(5)斜面培养基的制作将装含有琼脂的培养基的试管经灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度(切勿倾斜过小，以免培养基沾污棉塞)。待培养基凝固后，即成斜面(图7—3)。2．营养琼脂培养基(肉膏、蛋白陈、琼脂培养基)营养琼脂培养基是一种固体培养基，本实验制备后可供活性污泥纯种分离和细菌总数测定之用。(1)成分蛋白陈2.5g牛肉膏0.75g氯化钠1.25g琼脂2.5—5g蒸馏水250mL(2)制法1)将上列成分混合后，煮沸至琼脂完全溶解。2)用蒸馏水补充因蒸发而损失的水量。3)调整溶液的pH值为7.4—7.6。4)乘热用纱布或脱脂棉过滤(最好用保温漏斗)，并分装于试管中，每管约装10—15mL。如装在锥形瓶中，则250mL的锥形瓶，以装100mL左右为宜。管口或瓶口均以棉花塞住。5)置高压蒸汽灭菌器中，以121℃(1kg／cm2)灭菌20min，然后贮存于冷暗处备用。(三)无菌水的制备在试管或瓶内先盛以适量的自来水(不用蒸馏水，管口或瓶口用塞子塞好，并用牛皮纸扎紧)，使其灭菌后，其水量恰为9mL(用管)或99mL(用瓶)。此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。也可以先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管(所谓无菌吸管)取灭菌的自来水9mL或99mL加入管或瓶中。无菌水常用来稀释水样。(四)高压蒸汽灭菌上面所准备好的一切玻璃器皿、培养基等均需进行灭菌。本实验用高压蒸汽灭菌器灭菌，其操作和注意事项如下：1．加水热源为煤气灯或电炉者，需先加水至器内底层隔板以下1／3处。有加水口的，水由加水口加入，由玻璃管看水位至止水线即停止加水。若热源为蒸汽，则不必加水。2．把需要灭菌的器物放入灭菌器内，关严灭菌器盖，勿使漏气。3．打开出气口。4．点火。如热源为蒸汽，则应慢慢打开蒸汽进口，不要让蒸汽过猛地冲入灭菌器内。5．器内水沸腾以后，蒸汽逐渐驱除器内原有的冷空气。如灭菌器装有温度计，当指针指到读数100℃时，证明器内已经充满蒸汽、可以关闭出气口。如没有温度计，则当出气口排出的蒸汽相当猛烈时，可以认为灭菌器内冷空气已经全部被蒸汽驱尽，可以关闭出气口。这一点应持别注意，因为如果冷空气没有排尽，器内虽然达到了一定的压力，但并不会达到相应所需的温度。6．关闭出气口后，器内蒸汽将不断增多，压力和温度随着升高。当蒸汽压达到所需的压力时，即为灭菌开始时间，这时要调节火力大小，以维持所需的压力。灭菌时间的长短由灭菌物品决定。玻璃器皿、无菌水、营养琼脂培养基可用1kg／cm2(121℃)的压力灭菌20min，合糖的培养基用0.7kg／cm2(115℃)的压力20min。7．灭菌时间到达后，停止加热。8．待压力指针降到“0”时，打开出气口。如过早打开，管内和瓶内的培养基会因压力骤降，而温度并不同时很快下降，以致培养基翻腾，沾污锦塞。9．揭开器盖，取出灭菌的物品，将器内剩余的水放掉。10．待已灭菌的物品冷却后，置阴凉处。本实验，除学习培养基制备和高压灭菌法外，还要为下次实验作好难备。所以所用培养皿、吸管、试管、锥形瓶、烧杯等玻璃器皿以及无菌水、培养基等的量均须根据下次实验所需准备。四、思考题1．培养基是根据什么原理配制的?营养琼脂培养基中的成分各起什么作用?2．为什么湿热灭菌比干热灭菌优越?