华北理工水处理生物学教案06细菌的生长和遗传变异1

课程名称：《水处理生物学》第6讲次，总16讲摘要授课题目（章、节）第3章细菌的生长和遗传变异第一节细菌的生长及其特性本讲目的要求及重点难点：【目的要求】细菌生长量的测定方法：计数法与生长量测定法，各种方法的使用情况；间歇培养方式下细菌的生长曲线；生物膜的生长特点。【重点】间歇培养方式下细菌生长各个阶段的特点。【难点】理解间歇培养方式下细菌生长各个阶段的特点以及生长曲线的应用。内容【本讲课程的引入】在营养充分的条件下，细菌每二十分钟就会繁殖一代，细菌数量增长迅速。那在细菌数量会无限度增长吗，细菌的增长遵循什么样的规律呢？【本讲课程的内容】3.1细菌的生长及特性3.1.1生长与繁殖同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。生长一定程度后细胞分裂，这就是繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长（微生物重量或数目的增加）。群体生长＝个体生长＋个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才有意义，因此“生长”一般指群体生长。3.1.2细菌的生长测定方法（一）计数法1、直接计数法（显微镜）①涂片染色法：一定量样品涂布在载玻片上（红血球计数板），染色后计数。②滤膜染色法：一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。需要知道滤液的体积和滤膜的面积。在显微镜下计数，方法相同。③比例计数法——将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。比例——样品菌液与等体积（或成一定比例）的血液混合，观测二者比例红血球数已知(男性400~500万个／mL，女性350~450万个／mL)，平均400万个/mL全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF有必要区分细菌的死活吗？饮用水中卫生细菌学标准是TBC100个/mL（平板计数的标准），如果我们采用染色显微镜检测技术对刚刚加氯消毒的饮用水进行检测，可能会发现细菌数量会远远超过100个/mL，是不是饮用水就是不合格的饮用水呢？活菌直接计数（DVC，DirectViableCounts）美蓝染色法（酵母活细胞计数）（活细胞：无色，死细胞：蓝色）吖啶橙（AO）染色直接计数BacLight染色直接计数法N.A.法CTC染色直接计数FISH（荧光原位杂交法）FluorescenceInsituhybridization16sRNA的碱基组成—设计特异的探针（probe）2、间接计数法——一种活菌计数法①平板计数法：描述：CFU（colonyformationunit）/mL将一定体积的菌液，均匀涂布在固体培养基上（例如水中细菌总数采用的营养琼脂培养基），一定温度下培养，计数平板形成的菌落，一个菌落代表一个细菌。计数活细菌，死细菌不能够生长注意：一般可培养的微生物很少，计数结果与采用显微镜直接计数的结果差几百倍，甚至千、万。②滤膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养），然后把滤膜贴到培养基上，细菌获得营养而生长，形成菌落。——大肠菌群测定③液体计数法（MPN法，mostprobablenumber法）最可能数法特点：液体培养、统计学查表计数主要用于不能在平板培养基上形成菌落的菌（硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）将菌接种于液体培养基，经过一段时间培养，采用一定的技术来检测是否有细菌生长。例如硫酸盐还原菌的检测是利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行检测，按MPN法进行计数。（二）测生长量法（1）测体积：粗放的方法，离心或自然沉降后观察体积；（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种；105~110ºC下干燥后称重（干重约为湿重的10~20%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixedliquidsuspendedsolid）混合悬浮固体；MLVSS（mixedliquidvolatilesuspendedsolid）550ºC、2h、马福炉（3）比浊法/光密度法OD（opticaldensity）Λ＝450~660nm,可见光细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比（4）测细胞含碳量POC（particulateorganiccarbon）TOC（totalorganiccarbon）：总有机碳；DOC（dissolvedorganiccarbon）：溶解性有机碳（5）细胞含氮量：细菌含氮量12.5%、酵母为7.5%；粗蛋白量＝6.25×N量（6）DNA、蛋白质：同一细菌所DNA和蛋白质的量相对稳定，所以可以测DNA、蛋白质。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物醌类：1g细胞平均含1μmol醌类。3.1.3细菌的生长特性（一）几种培养方式（1）间歇培养（Batchcultivation）：将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。（2）连续培养（continuouscultivation）是一种连续进料又连续出料的培养方式，根据控制因素的不同分为恒浊连续培养（turbidostat）：培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长，通过控制进料流速保持细菌浊度一定，使其处于对数生长期。恒化连续培养（chemostat）：固定恒定的进料流速，同样的流速排出，反应器中营养物质浓度不变，为限制性营养因子控制生长。（3）半连续培养（semi-batchcultivation）、半间歇式（4）分批补料式培养（fedbatch）：以低速把高浓度的营养物质连续加入培养器中，但不出料。特点：能任意控制培养液中的底物浓度，所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡，所以能保持一定的浓度，体积是随时间变化的。接种（二）间歇培养（Batchcultivation）条件下细菌的生长曲线（growthcurve）细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。（1）细菌生长曲线（按细菌重量绘制）（2）细菌生长曲线（按细菌数目的对数绘制）活菌数00时间细菌生长速度缓慢期对数期稳定期衰老期总菌数细菌数的对数时间活细菌重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段Fillanddraw细菌生长各个阶段的特点为：①缓慢期（适应期））底物特点：底物充足（重要）细菌特点：生长速率常数近于零（重要）细胞形态变大，但基本不分裂（重要）rRNA含量增高合成代谢较活跃②对数生长期底物特点：底物充足，大量被细菌消耗，降解速率最高（重要）细菌特点：生长速率最大，呈对数生长，世代时间（generationtime）最短（重要）酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀③稳定期（平衡器、静止期）底物特点：底物被大量消耗，不能够维持对数期细菌高生长速率所需要的有机物质，导致细菌生长率下降（重要）细菌特点：细菌数量增多，由于底物被大量消耗，很难维持细菌的对数生长速率。生长和死亡处于平衡状态，净增长速度为零（重要）④衰老期（内源呼吸期）底物特点：底物被微生物大量耗尽，微生物因得不到营养，而进行内源呼吸。（重要）细菌特点由于食物大量被消耗，细菌由于得不到营养而利用自身的营养物质来维持生理活动，细胞会发生自溶现象（autolysis）（重要）往往产生芽孢（三）细菌生长的数学描述生长与基质浓度的关系微生物比增长速度：单位时间，单位微生物量的增加量（四）细菌生长期与废水生物处理：水处理中如何避免缓慢期？接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化（以后详细讲）微生物维持到对数期可获得高的处理能力，即分解速度高，但处理效果不一定好？菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。故传统的活性污泥法常运行在这个范围。衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合，如延时曝气及污泥消化，出水水质好。1dxdtx微生物代谢速率与食料/微生物的关系：3.1.4微生物膜的生长特性（一）生物膜的生长液体培养基中加入固体物质（载体），微生物在其表面吸附、生长、繁殖形成形成膜，这种膜叫微生物膜。生物膜的生长，膜厚的增加，密度也将发生变化从单位固体表面积上的微生物量（mg/cm2）上看可分为6个阶段延滞期、加速增长期、恒速增长期、减速增长期、安定期、脱落期（1）延滞期：细胞吸附在固体表面上的过程（沉降）影响吸附速度的因子：材质、表面性质、形状、细胞的性质、操作条件（2）加速增长期：还没有形成完整的膜食料/微生物代谢速率内源呼吸阶段生长率下降阶段生长率上升阶段（沉降性能好）（沉降性能差）大多数活性污泥处理系统运行范围延时曝气，污泥消化（3）恒速增长期：活性细胞量达到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。（4）减速增长期：恒速增长期与安定期的过渡期，持续时间短。（5）安定期：增长速度与脱落速度相平衡，膜量及膜厚达到最大值。（6）脱落期：外因：流体的剪切力；内因：细菌的死亡、气泡的形成，细胞外高分子量的变化。（二）生物膜的特性（1）有效膜厚：并不是全部有活性，70～200μm（平均100μm），并不是越厚越好。（2）密度（与膜厚有关）微生物膜的湿密度：密度有时小于水，一般接近于1。（因为有气泡的存在）（3）组成：（g-/g-生物膜）湿生物膜组成（体积比）：细胞5-15%，气泡2-18%，水70－90%生物膜干组成：（g-/g-生物膜）COD：0.47、TOC：0.46、T-N：0.11、T-P：0.22（4）生物膜的测量方法膜厚＝膜体积/载体表面积＝生物膜湿重/表面积生物膜湿重＝（载体＋膜）－载体生物膜生物量的测定方法：超声波脱落，按照细菌数量测定。【本讲课程的小结】本讲主要介绍了细菌生长的测定方法以及间歇培养方式下细菌的生长曲线，主要掌握各个阶段细菌生长与底物利用的特点。【本讲课程的作业与复习】作业：间歇培养方式下细菌的生长曲线（按照对数绘制），并介绍各个阶段细菌生长与底物利用的特点？课下复习：了解细菌生长量的测定方法，理解细菌生长曲线。