华北理工水处理生物学教案12水的卫生细菌学2

课程名称：《水处理生物学》第12讲次，总16讲摘要授课题目（章、节）第五章水的卫生细菌学第四节水的卫生细菌学检验第五节水中微生物控制方法本讲目的要求及重点难点：【目的要求】水的卫生细菌学检验；水的微生物控制；水中的病毒控制。【重点】水的卫生细菌学指标的检测方法【难点】氯消毒机理内容【本讲课程的引入】我们知道了水的卫生细菌学标准，但如何进行检测呢？又通过什么样的方法来保证饮用水安全卫生呢？【本讲课程的内容】5.4水的卫生细菌学检验一、细菌总数（TBC）的测定（1）水样的采集采集细菌学检验水样，必须按照无菌操作进行；从采样到检验不超过2h；10℃以下冷藏不超过6h。采样器皿必须经过灭菌；自来水采样应该用酒精灼烧水龙头/酒精消毒，放水3min后取样；江河湖库水样沉入水下10-15cm，瓶口向水流上游取样。（2）制备营养琼脂培养基。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24小时培养后，所生长的细菌菌落的总数。它是判断饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。生活饮用水卫生标准：细菌总数100(CFU/mL)水样的细菌总数（TBC）采用国家环保局《水和废水标准检验法》[91]中的方法，以营养琼脂为培养基，于37℃培养24h，计数能够生长的细菌。营养琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。异养菌平板计数（HeterotrophicPlateCounting，HPC）是采用R2A培养基，20～28℃培养7d，计数能够生长的异养菌。R2A培养基成分为：酵母浸膏（Yeastextract）0.5g，聚合蛋白胨（PolypeptoneorproteosepeptoneNo.3）0.5g，酸水解酪素（Casaminoacids）0.5g，葡萄糖（Glucose）0.5g，可溶性淀粉（Solublestarch）0.5g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O0.05g，丙酮酸钠（Sodiumpyruvate）0.3g，琼脂15g，超纯水1000mL。（3）用作细菌检验的器皿、培养基等均需按方法要求进行灭菌，以保证所检出的细菌皆属被测水样所有。（4）以无菌操作方法用1ml灭菌吸管吸取混合均匀的水样(或稀释水样)注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并旋摇平皿使其混合均匀。每个水样应做两份（平行样），还应另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。待琼脂培养基冷却凝固后，翻转平皿，置于37℃恒温箱内培养24小时，然后进行菌落计数。（5）用肉眼或借助放大镜观察，对平皿中的菌落进行计数，求出1mL水样中的平均菌落数。二、多管发酵法测定总大肠菌群总大肠菌群：总大肠菌群是指那些能在37℃、48小时之内使乳糖发酵产酸、产气、需氧及兼性厌氧的、革兰氏阴性的无芽抱杆菌。以每升水样中所含有的大肠菌群的数目表示。总大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。发酵法可用于各种水样(包括底泥)，但操作较繁琐，费时间。滤膜法操作简便、快速，但不适用于浑浊水样。因为这种水样常会把滤膜堵塞，异物也可能干扰菌种生长。（1）配制培养基：乳糖蛋白胨培养液、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、品红亚硫酸钠培养基、伊红美蓝培养基。（2）初步发酵试验：在灭菌操作条件下，分别取不同量水样于数支装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，得到不同稀释度的水样培养液，于37℃恒温培养24小时。该试验基于大肠菌群能分解乳糖生成二氧化碳等气体的特征，而水体中某些细菌不具备此特点。但是，能产酸、产气的绝非仅属于大肠菌群，还需进行复发酵试验予以证实。（3）平板分离：初步发酵试验后，将产酸产气及只产酸的发酵管接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，于37℃恒温培养24小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。（4）品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金屑光泽的菌落；深红色，不带或赂带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。（4）复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则取该菌落的另一部分再接种于装有乳糖蛋白陈培养液的试管(内有倒管)中，每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1—3个，于37℃恒温培养24小时，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。大肠菌群计数：根据证实有大肠菌群存在的阳性管数，查总大肠菌群数检数表，报告每升水样中的总大肠菌群数。三、滤膜法测定总大肠菌群将水样注入已灭菌、放有微孔滤膜(孔径0.45μm)的滤器中，经抽滤，细菌被截留在膜上，将该滤膜贴于品红亚硫酸铀培养基上，37℃恒温培养24小时，对符合发酵法所述特征的菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。凡属革兰氏阴性无芽抱杆菌者，再接种于乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基中，在37℃恒温条件下，前者经24小时培养产酸产气者，或后者经6—8小时培养产气者，则判定为总大肠菌群阳性。四、粪大肠菌群测定为区别存在于自然环境中的大肠菌群细菌和存在于温血动物肠道内的大肠菌群细菌，可将培养温度提高到44.5℃，在此条件下仍能生长并发酵乳糖产酸产气者，称为粪大肠菌群。粪大肠菌群也用多管发酵法或滤膜法测定。5.5水中微生物的控制方法病原微生物的去除——水的消毒加氯消毒、臭氧消毒、紫外线消毒、藻类的去除一、病原微生物的去除1、加氯消毒的原理氯在水中的反应（无氨氮时）Cl2+H2O————HOCl+H++Cl-(1)HOCl————H++OCl-(2)主要靠HOCl起作用，HOCl扩散到带负电的细菌表面，通过细菌的细胞壁穿透到细菌内部，然后靠氧化作用破坏细菌的酶系统，使细菌死亡。OCl-因为带负电，难于接近带负电的细菌表面，杀菌效果差。并非所有氧化剂都具有氧化作用，例如过氧化氢，氧化能力强，但是许多细菌具有分解过氧化氢的酶，可以分解过氧化氢，所以没有消毒作用。2、漂白粉的有效氯为35%有效氯：只有能够得到电子的Cl原子或更高价的离子才能够起到氧化作用，而消毒。漂白粉中CaOCl2（Ca2+，O2-，Cl1+，Cl1-），只有Cl1+能够得到2个电子，恰好相当于一个Cl2分子。1mol的CaOCl2（分子量127）氧化能力相当于1molCl2，则漂白粉中的有效氯为2×35.5/127=56%，由于漂白粉中含有CaOCl2为62.5%因此漂白粉中的有效氯为56%×62.5%=35%3、次氯酸在不同pH和温度条件下所占比例的计算4、加氯消毒标准游离余氯在与水接触30分钟后应不低于0.3mg／L，管网末梢水不应低于0.05mg／L(适用于加氯消毒)二、藻类的去除由于天然水体中有机物较少，无机物较多（N、P）时，藻类大量繁殖，提供给异养型生物繁殖的有机养料，同时使得水体水质变差，主要表现在发生混浊，颜色气味不良水体富营养化溶解氧下降，鱼类死亡作为饮用水水源，藻毒素问题、堵塞滤池、色度问题必须控制藻类的过渡繁殖：杀藻药剂：CuSO4（0.3~0.5mg/l能杀死大部分藻类，但不能分解臭味物质，对鱼类也有毒性）、HClO（除去臭味物质，0.5~1mg/l，产生消毒副产物）超声波：破坏细胞，使之失去上浮能力而沉降，在日本已得到实际应用。5.6水中病毒及其检验水环境中的病毒脊髓灰质炎病毒肝炎病毒其他肠道病毒——柯萨奇病毒和埃可病毒水中病毒的检验——蚀斑检验法0204060801004567891011pHHOCl(%)将猴子的肾脏用pH7.4～8.0的胰蛋白酶溶液处理。胰蛋白酶的作用是使肾脏组织的胞间质发生解聚作用，因而使细胞彼此分离。用营养培养基洗这些悬浮的细胞。将细胞沉积在40×110mm的细胞瓶的平面上，并形成一层连续的膜。将水样接种到这层膜上，再用营养琼脂覆盖。水样中如果有肠道病毒，就会破坏组织细胞，增殖的病毒紧接着破坏临接的细胞。在24～48h内，就可以用肉眼看到。病毒群体形成的斑点称为蚀斑。每升水样没有1个病毒蚀斑，饮用才安全。【本讲课程的小结】本讲介绍了大肠菌群作为饮用水的细菌标准、水中细菌的检测、水中微生物的控制以及病毒的控制。【本讲课程的作业与复习】课下复习大肠菌群作为饮用水的细菌标准、水中细菌的检测、水中微生物的控制以及病毒的控制。