浙大《药物分析》实验指导讲义——实验案例分析

浙江大学网络教育精品资源共享课药物的鉴别试验案例分析通过数组案例分析，着重掌握典型鉴别试验与药物结构特征的关系，以及相似或相关分子结构之间的区别；熟悉复杂体系中组分的鉴别方法选择与设计。案例一有一药物，可能是地西泮、苯佐卡因或盐酸丁卡因，请用一种化学方法区别之。结构分析:H2NOCH3O苯佐卡因CH2OCCNClCH3N地西泮OONCH3CH3H3CNH.HCl盐酸丁卡因根据上述结构式，三者均为含氮结构药物，但氮所处情况不同。苯佐卡因和盐酸丁卡因均为芳胺类药物，苯佐卡因分子结构中含有游离芳伯氨基，具有芳香第一胺反应；盐酸丁卡因分子结构中含有芳仲氨基，氨基上1个氢被丁基取代，不能水解，故不具芳香第一胺反应，但可与亚硝酸钠作用形成N-亚硝基化合物的乳白色沉淀；地西泮为苯骈二氮杂卓类药物，七元环上含叔氮，不具芳香第一胺反应。在强酸性溶液中可被水解，使七元环开环，形成芳仲氨基。因此，可选用芳香第一胺反应来区别三者。反应原理:浙江大学网络教育精品资源共享课H2NOCH3O+NaNO2+2HClCl-N+2OCH3O+NaCl+2H2O+OH+NaOHOCH3OCl-N+2COOC2H5NNHO+NaCl+H2O苯佐卡因.HCl+NaNO2HH3CNCOORH3CNNOCOOR+H2O+NaCl盐酸丁卡因分析方法:供试药物可能结果①（－）——————地西泮可能结果②（橙黄～猩红色）↓——苯佐卡因该案例说明的主要问题：适用第一芳香胺的一般鉴别试验的结构要求，类似结构之间的区别，以及鉴别反应的原理、主要试剂和结果现象。案例二有一药物，可能是①对乙酰氨基酚、②对氨基水杨酸钠、③阿司匹林或④丙磺舒，请用化学法区别之。结构分析:碱性β-萘酚NaNO2稀HCl①无明显现象——进一步反应②无明显现象——进一步反应③白色↓————盐酸丁卡因橙黄～猩红色白色浙江大学网络教育精品资源共享课HONCH3OH对乙酰氨基酚OHOCH3OO阿司匹林SHONCH3CH3OOO丙磺舒ONaOHONH2对氨基水杨酸钠对乙酰氨基酚具有酚羟基，可与三氯化铁反应，酚羟基对位为乙酰氨基，可水解产生芳伯氨基，具有芳香第一胺反应；阿司匹林具水杨酸结构，但酚羟基被酯化，不能与三氯化铁直接反应，只有在酯键水解后才有此反应；丙磺舒为苯甲酸类药物，在中性条件下可与三氯化铁反应，形成有色沉淀；对氨基水杨酸钠既具有芳伯氨基，又具有水杨酸结构，因此，具有芳香第一胺反应和三氯化铁反应（需先用酸中和钠盐），同时具钠离子的焰色反应。根据上述结构分析结果，可采用三氯化铁反应，适当改变反应条件进行区别。反应原理:COOHOHH2OFeCl3pH4-6COO-O-2Fe3FeOHOCH3OO阿司匹林SHONCH3CH3OOOFeCl3pH5-63FeSONCH3CH3OOO丙磺舒-分析方法:供试品水溶液可能结果①蓝紫色——对乙酰氨基酚②无明显现象——进一步试验③无明显现象——进一步试验④无明显现象——进一步试验米黄色↓FeCl3紫色浙江大学网络教育精品资源共享课②②紫红色——对氨基水杨酸钠③③无明显现象——进一步试验④④无明显现象——进一步试验③③紫色——阿司匹林④④无明显现象——进一步试验④米黄色↓——丙磺舒该案例说明的主要问题：适用于三氯化铁鉴别反应的药物结构要求，类似结构之间的区别，反应条件的不同，以及鉴别反应的原理、主要试剂和结果现象。案例三有三瓶药物因保管不当，标签失落，需用适当方法对它们进行区别并确证。根据现有线索，这三瓶药物可能是①苯巴比妥、②异烟肼和③维生素C。结构分析:NHNH3COOOH5NNNH2OγHOOHOHCHOOHHO苯巴比妥异烟肼维生素C苯巴比妥具有丙二酰脲结构，在碳酸钠溶液中可与硝酸银作用，产生二银盐白色沉淀。苯巴比妥5位取代基有苯环，可硝化、亚硝化，或与甲醛-硫酸反应。异烟肼分子结构中吡啶环γ位上有酰肼基取代，具有较强还原性，可还原硝酸银，产生银镜反应，同时肼基可与芳醛缩合，产生黄色腙。维生素C结构与糖类相似，具有糖类性质和反应；其分子中烯二醇基具有很强的还原性，可与多种氧化剂反应，与硝酸银作用，产生黑色金属银沉淀。加稀盐酸使成酸性FeCl3可能结果H2O△FeCl3可能结果加氢氧化钠溶液调pH值5～6FeCl3浙江大学网络教育精品资源共享课因此，上述药物可用硝酸银反应进行初步区别，然后选择各自特征反应进一步确证。初步区别试验:（1）反应原理+NaNO3+NaHCO3NHNR1R2OOOH+Na2CO3+AgNO3NNR1R2OOOAgAg白色+AgNO3+NH3H2ONONH4O+Ag+N2+NH4NO3+H2ONNNH2OH银镜OOHOHCHOOHHO+2AgNO3OCHOOHHOOO+2HNO3+2Ag（2）分析方法未知物①水溶液（－）未知物②水溶液（－）未知物③水溶液黑色沉淀——维生素C未知物①水溶液（－）苯巴比妥未知物②水溶液银镜——异烟肼进一步确证试验:（1）苯巴比妥的确证：可选择母核丙二酰脲反应（硝酸银反应和铜-吡啶反应）、取代基苯环的反应（甲醛-硫酸试验、硫酸-亚硝酸钠试验）进行鉴别。现以甲醛-硫酸试验为例。鉴别方法：取供试品约50mg，置试管中，加甲醛试液1ml，加热煮沸，冷却，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，使成两液层，置水浴中加热，接界面显玫瑰红色。（2）异烟肼的确证：可选择吡啶环的开环反应（戊烯二醛反应、二硝基氯苯反应）、酰肼基的缩合反应进行鉴别。现以与芳醛的缩合反应为例。鉴别方法：取供试品0.1g，加水5ml溶解后，加10%香草醛的乙醇溶液1ml，摇匀，微热，放冷，即析出黄色结晶；滤过，用稀乙醇重结晶，在105℃干燥后，测定熔点，熔点为黑色分别加AgNO3试液分别加氨制AgNO3试液进一步试验浙江大学网络教育精品资源共享课228～231℃，熔融时同时分解。（3）维生素C的确证：可选择各种氧化剂与之反应，如与2，6-二氯靛酚反应：取供试品0.2g，加水10ml溶解，取该溶液5ml，加二氯靛酚钠试液1～2滴，试液的颜色即消失。注：2，6-二氯靛酚为一染料，其氧化型在酸性介质中显玫瑰红色，在碱性介质中显蓝色，与维生素C作用后生成还原型无色酚亚胺。该案例说明的主要问题：硝酸银是一个弱氧化剂，能与多种具有还原性药物反应，自身被还原或生成相应的银盐，产生不同的结果现象，可以区别同具有还原性而具不同结构的药物。同时也说明药物的一个鉴别反应只能证明其某一个性质，不能作为判断药物真伪的唯一依据，必须结合药物的其他结构特征，选择相对专属的方法进一步确证。案例四复方吡啦西坦片中部分组分的鉴别方法的建立。处方分析与问题提出：复方吡啦西坦片剂由吡啦西坦、脑蛋白水解物、硫酸软骨素、谷氨酸、维生素B1、B2、B6设计思路：和维生素E等8种药物加适量辅料制成。各成分含量差异悬殊，对鉴别方法的专属性和灵敏度提出了挑战。如何排除干扰，选择灵敏的方法进行分别鉴别呢？首先应了解各组成的理化性质、各原料药物及单方制剂的鉴别方法，经分析比较不同鉴别试验的专属性，选取其中一种方法进行试验，同时进行阳性对照和阴性对照试验。通常取被测组分的原料药或纯品作为阳性对照，取缺被测组分的复方制剂作为阴性对照，与复方制剂同法操作，比较试验结果。举例说明：以复方吡啦西坦片剂中吡啦西坦和维生素B1一、吡啦西坦的鉴别：的鉴别为例，说明鉴别方法的建立过程。查阅《中国药典》吡啦西坦及其制剂的鉴别方法有HPLC法和高锰酸钾法，考虑到浙江大学网络教育精品资源共享课制剂组成复杂，化学鉴别法的干扰因素多，故选择具有分离分析功能、专属性强的HPLC法作为吡啦西坦的鉴别方法。（1）溶液配制供试品溶液：取本品细粉适量（约相当于吡拉西坦0.1g），置100ml量瓶中，加水适量，超声使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液适量，用水稀释10倍，摇匀，作为供试品溶液（0.1mg/ml）。阳性对照液：取吡拉西坦对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为吡拉西坦阳性对照液。阴性对照液：按处方量配制缺吡拉西坦的空白制剂，照供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照液。（2）测定方法色谱条件：ODS色谱柱（250mm×4.6mm，5um），以甲醇-水（10:90）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为210nm。测定：取上述三种溶液各20µL，注入液相色谱仪，记录各溶液的HPLC色谱图。供试品溶液的色谱图中吡拉西坦主峰的保留时间应与阳性对照液中吡拉西坦峰的保留时间一致，在吡拉西坦色谱峰处，阴性对照液的HPLC图中无色谱峰出现。二、维生素B1维生素B的鉴别：1（1）溶液配制：取本品5片（约相当于维生素B有个特殊反应——硫色素反应，具有很高的专属性和灵敏度，因此，可用来作为鉴别方法。12.5mg），置研钵中，加水25mL，充分研磨，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取维生素B1适量，加水溶解并稀释至0.1mg/ml的溶液，作为阳性对照液。按处方量配制缺维生素B1（2）测定方法：取上述三种溶液各10mL，分别加氢氧化钠试液15mL，铁氰化钾试液0.5mL，正丁醇5mL，强力振摇2分钟，放置使分层，置紫外灯下观察，供试品溶液和阳性对照液的上层显蓝色荧光，加盐酸使成酸性，荧光即消失；再加氢氧化钠试液使成碱性，荧光又出现；阴性对照液无此现象。的空白制剂，照供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照液。该案例说明的主要问题：如何建立药物的鉴别试验方法，进行方法的专属性考察。浙江大学网络教育精品资源共享课药物的含量测定案例分析通过药物含量测定方法的建立，掌握如何根据药物结构、理化性质、制剂因素等选择合适的含量测定方法，以及常规分析方法的测定原理、反应条件与含量计算方法。案例——吩噻嗪类药物的含量测定方法设计查阅有关书籍、文献，设计2～3种测定吩噻嗪类药物含量的方法，并说明反应原理，主要试剂和实验条件，以及含量计算方法。结构分析：吩噻嗪类药物具有硫氮杂蒽母核，代表性药物有：异丙嗪、氯丙嗪、奋乃静、氟奋乃静、三氟拉嗪、硫利达嗪等。结构通式如下：NSR'R21345678910母核为共轭三环π系统，10位R取代基为具有2～3个碳链的二甲或二乙氨基，或含氮杂环，2位R′取代基通常为H、Cl、CF3、SCH3非水碱量法：等。分析其结构，主要具有如下特征：①多个吸收峰的紫外吸收光谱；②10位R取代基上N原子具有碱性；③环上硫原子易被氧化成亚砜和砜，未被氧化的硫原子可与某些金属离子（如钯离子）形成有色配位化合物。因此，该类药物的含量测定可以采用紫外分光光度法、非水碱量法、比色法，以及HPLC法。（1）方法原理：非水碱量法是本类原料药的主要含量测定方法。利用本类药物10位R取代基上N原子的碱性，在非水溶液中，用高氯酸滴定剂进行滴定。一般R取代基上有n个氮原子，消耗n摩尔高氯酸，如奋乃静、盐酸三氟拉嗪等消耗2摩尔高氯酸；盐酸氯丙嗪仅消耗1摩尔高氯酸。浙江大学网络教育精品资源共享课NNOHSNClSNNCH3CH3Cl.HClSNNCH3H3CCH3.HCl奋乃静盐酸氯丙嗪盐酸异丙嗪（2）主要试剂与指示终点方法：采用的非水溶剂有冰醋酸、冰醋酸-醋酐、醋酐-甲酸等。指示终点的方法有结晶紫指示剂法、电位滴定法。（3）注意事项：①本类药物临床上应用的多为盐酸盐，由于盐酸酸性较强，影响滴定反应，故在滴定前需加入足够量醋酸汞，使与盐酸酸根形成氯化汞而消除干扰。②非水溶剂对温度较敏感，若滴定温度与标定标准液时温度不一致，则需按校正公式对标准液浓度进行校正（温差在10℃以内），或重新标定（温差超过10℃）。③非水滴定应避免水分引入，所用仪器均应干燥。若用电位法指示终点，必须将甘汞电极内盛有的饱和氯化钾水溶液改换成饱和氯化钾的无水甲醇溶液。（4）含量计算：采用滴定度法计算。含量（%）=%100×××WFTV紫外分光光度法：（1）方法原理：本类药物在紫外光区205nm、254nm、300nm附近有三个吸收峰值，最强峰在254nm附近，一般选择254nm附近的峰进行测定，但当制剂中辅料对测定有干扰时，则可选用3