长春中医大《中药化学》课件03分离精制方法-2色谱分离法

1色谱分离法Chromatography1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行色带由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，称为色谱法色谱100年回顾瑞典Uppsala大学对生化分离方法贡献2不同色谱材料不同操作方式将各种色谱组合应用分离精制鉴定色谱分离法Chromatography思考问题：1.常用的分离材料有哪些？2.每种分离材料的结构与性质？3.分离原理？3不同操作方式薄层色谱（ThinLayerChromatography）柱色谱（columnChromatography)纸色谱(PaperChromatography)掌握各种色谱方式的缩写色谱分离法Chromatography常用分离材料性质及分离原理总结对比（硅胶、大孔吸附树脂、反相硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂）4不同分离原理吸附色谱、排阻色谱分配色谱、离子交换色谱吸附色谱利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离排阻色谱（分子筛色谱）根据混合物中各成分分子大小进行分离分配色谱利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同进行分离离子交换色谱利用混合物中各成分解离度的差异进行分离5硅胶/氧化铝/聚酰胺/活性炭不同色谱材料葡聚糖凝胶离子交换树脂大孔吸附树脂吸附色谱排阻色谱分子筛离子交换分子筛/吸附色谱6吸附色谱常用吸附剂硅胶（应用广泛）氧化铝（碱性氧化铝）聚酰胺（酚类/醌类/黄酮类)活性炭（水溶性、氨基酸、糖类、苷类）化合物结构R-COOHAr-OHR-OHR-NH2,R-NH-R'R-CHOR-CO-R'R-COO-R'R-O-R'R-XR-H利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离化合物极性与Rf值一般规律：化合物极性越大，Rf值越小展开剂（洗脱剂）：常用亲脂性或中等极性展开剂检视：用显色剂或紫外光灯7吸附原理解读固液吸附三要素组成吸附剂溶质溶剂吸附剂溶质1溶质2溶质3溶剂吸附-解吸附过程影响因素吸附剂的极性溶剂的极性化合物极性极性大小是影响吸附主要因素硅胶无机硅胶是一种高活性吸附材料，用硅酸钠和硫酸反应，并经老化、酸泡等一系列后处理过程而制得，硅胶属非晶态物质，其化学分子式为mSiO2．nH2O；难溶于水常用于分离的种类：硅胶G；硅胶GF254；硅胶H粒度：具有不同粒度（200~300目或100目）应用范围广泛，但分离生物碱易产生拖尾现象氧化铝Al2O3白色晶状粉末分类：中性氧化铝和碱性氧化铝常用碱性氧化铝：适于分离生物碱或中性亲脂性成分（甾、萜类）不适用于酸性成分（含酚羟基或羧基）（为什么）吸附剂与被吸附成分发生死吸附而难以解吸附◆均为极性吸附剂硅胶与氧化铝吸附特点◆对极性物质具有较强的亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附◆溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出超强的吸附能力溶剂极性增强则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱◆溶质即使被硅胶、氧化铝吸附但一旦加入极性较强的溶剂时以可被后者置换洗脱下来如何理解被分离成分-吸附剂-展开剂（洗脱剂）的关系利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离吸附解吸附化合物极性越大，Rf值越小实验课实验结果分析分析不同展开剂对Rf值的影响吸附剂：硅胶G展开剂：石油醚（）-乙酸乙酯（4:1）（9:1）显色剂：5%香草醛硫酸溶液极性及其强弱总结化合物结构R-COOHAr-OHR-OHR-NH2,R-NH-R'R-CHOR-CO-R'R-COO-R'R-O-R'R-XR-H高级脂肪酸与葡萄糖极性大小比较酸性、碱性及两性化合物的极性受分子状态的影响化合物的极性由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合原因影响溶剂极性：与偶极矩、极化度及介电常数等概念相关吸附法分离的应用需要解决问题1.吸附剂的选择2.吸附剂与样品用量3.色谱柱规格与装柱4.上样5.洗脱剂选择及洗脱吸附剂的选择：避免死吸附，如酸性物质不适合选择氧化铝吸附剂与样品量：吸附剂用量一般为试样30‾60倍；试样极性小，难分离可提高到100‾200倍色谱柱规格：高度与直径比（15:1）-（20:1）上样：用溶剂极性小的试剂溶解样品；如果溶解度不好，可先用极性大溶剂溶解再用少量硅胶拌匀，并在低温下挥散，置五氧化二磷干燥器中干燥，研粉后铺在吸附柱上洗脱：洗脱剂的极性应逐步增加，跳跃不能太大，多用混合溶剂洗脱剂如何筛选：可通过薄层系统筛选，一般TLC展开时使组分Rf值达到0.2‾0.3的溶剂系统，可选择柱色谱分离该组分的最佳溶剂系统聚酰胺聚酰胺(PA，俗称尼龙)是美国DuPont公司最先开发用于纤维的树脂，于1939年实现工业化。它是由一系列的酰胺基团聚合而成的一类高分子化合物，按其性质可分为两大类:非反应性或中性聚酰胺及反应性聚酰胺。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂对碱较稳定对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键(-CO-NH-)的高分子聚合物酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷-----以静电引力形成吸附溶液中的阴离子与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基（或羧基）的化合物形成氢键而被吸附---而与不能形成氢键的化合物分离聚酰胺分离示意图19聚酰胺的薄层色谱条件被分离物质酚类、酸类、醌类、黄酮类等含酚羟基（或羧基）化合物吸附剂聚酰胺薄膜聚酰胺色谱柱展开剂或洗脱剂水/甲醇/丙酮/稀氢氧化钠甲酰胺比较硅胶与聚酰胺分离的相同点和不同点聚酰胺不适合分离哪类成分？20液-液分配柱色谱（与萃取法比较）将两相溶剂中一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中加入与固定相不相混溶的另一相溶剂,作为流动相物质在两相溶剂中相对做逆流移动在移动过程中不断进行动态分配而得以分离上述方法称为液-液分配柱色谱21正相分配色谱固定相极性大于流动相固定相：水或缓冲溶液色谱用载体主要有硅胶硅藻土及纤维素（粉）流动相：三氯甲烷乙酸乙酯丁醇等反相分配色谱固定相极性小于流动相固定相：石蜡油色谱用载体主要有硅胶硅藻土及纤维素（粉）流动相：水、甲醇等正相分配色谱与反相分配色谱流动相的极性小于固定相极性Paperchromatography(PC)---水展开剂：正丁醇-醋酸-水（4:1:5)上层比较：（1）芦丁和槲皮素Rf值（2）glc和rhaRf值正相分配色谱流动相的极性大于固定相极性固定相：十八烷基硅胶（ODS）或C8键合相流动相：甲醇-水/乙腈-水反相分配色谱24正相分配色谱与反相分配色谱新型固定相将硅胶经过结构修饰，键合上长度不同的烃基（R）形成亲脂性表面而成种类根据烃基（-R）长度为乙基、辛基或十八烷基，分别命名为RP（reversephase)-2RP（reversephase)-8（辛烷键合硅胶）RP（reversephase)-18（ODS）（十八烷基硅烷键合硅胶）亲脂性比较：RP-18＞RP-8＞RP-225加压液相色谱（HPLC）经典液相色谱载体颗粒较大（硅胶100‾150μm）流动相靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液人工收集再分段分析柱效相对低分离时间较长加压液相色谱柱效增加载体颗粒较小（硅胶），机械强度大及比表面积大如有薄壳型或表面多孔型硅球，其上可键合不同极性化合物，衍生出多种极性吸附剂提高分离速度缩短时间通过施加不同压力快速色谱（flashchromatography)低压液相色谱（LPLC)高压液相色谱（HPLC)高效液相色谱（HPLC)26高效液相色谱仪27涡流色谱分离生物样品的新技术利用大粒径的填料，使流动相在高流速下产生涡流状态从而对生物样品进行净化与富集流速高，但分离效果并没有降低在流动相中，溶质分子都存在浓度趋同均一扩散，涡流作用增加溶质在柱内浓度梯度的变化，使分子扩散加快高流速的流动相在柱内形成漩涡，会加快溶质分子从流动相到固定相传质主要模式：单柱模式、双柱模式及多柱模式单柱模式，涡流色谱柱与检测器相连，完成样品净化双柱模式：增加分析柱，主要完成富集多柱模式：多个涡流色谱柱通过切换阀与分析柱相连，可实现不同目的高通量样品的分析28大孔吸附树脂结构与组成以苯乙烯等为原料，加入致孔剂甲酰胺聚合而成多为白色球状颗粒性质：在溶剂中溶胀，室温下对稀酸、稀碱稳定分离原理：以吸附性与分子筛相结合的分离材料，吸附力是范德华力或氢键吸附分为非极性、弱极性和中极性29大孔吸附树脂操作步骤：预处理：用乙醇、水处理上样：试样制成水溶液洗脱：先用水洗；再用极性由低到高的不同浓度乙醇洗脱树脂再生：通过酸碱处理可再生使用大孔吸附树脂是一类没有可解离基团、具有多孔结构、不溶于水的固体高分子物质吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料如经典分离糖与苷类化合物、生物碱的精制等操作见人参皂苷类成分分离实验301.树脂型号---比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键，即树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、孔容）影响大孔树脂分离的因素2.被吸附化合物性质—如分子量大、极性小的化合物与非极性树脂吸附作用强3.洗脱剂—极性小、洗脱力强；可以用酸碱性洗脱剂4.pH值影响—对于酸碱性化合物选择大孔树脂分离5.温度—物理吸附过程，温度低不利于吸附6.其他—洗脱液流速、树脂粒径、树脂柱的高度31凝胶过滤色谱（排阻色谱、分子筛色谱）凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质根据混合物中各成分分子大小进行分离含有不同分子大小的组分样品进入凝胶柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔内只能分布在凝胶颗粒的间隙中以较快的速度流过凝胶柱成分流出色谱柱的顺序：大分子最先流出；其次中等大小；最后小分子判断小分子行为？葡聚糖凝胶(SephadexG)型号SephadexG–由葡聚糖和甘油基通过醚桥（-O-CH2-CHOH-CH2O-)相交联而成的多孔性网状结构，具亲水性，在水中溶胀SephadexG-100含义：Se—separation（分离）的缩写；pha—医药公司的缩写Se是separation（分离）的缩写；pha是医药公司的缩写；dex是葡聚糖的缩写；G是凝胶gel字头；25代表1g干胶可吸取2.5ml水dex—葡聚糖的缩写；G—凝胶gel字头100代表1g干胶可吸取10ml水葡聚糖凝胶(Sephadex)性质交联度与吸水性凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联度的数量和反应条件交联度与加入交联剂量有关，加入交联剂越多，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀越小，反之SephadexG只适用在水中应用适用条件SephadexG只适用在水中应用SephadexLH-20在SephadexG-25的羟基上引入羟丙基而成醚键的结合态二者差别是羟基总数不变，但碳原子数增加SephadexLH-20适用在水中、有机溶剂或它们与水组成混合溶剂（醇）中应用型号吸水量(ml/g）床体积(ml/g）分离范围(分子量）蛋白质多糖最少溶胀时间室温沸水浴G-101.0±0.12‾3＜700＜70031G-252.5±0.24‾61000‾1500100‾500062G-505.0±0.39‾111500‾30000500‾1000062G-100G-150G-200SephadexG的性质36离子交换树脂分离材料分离原理37生物碱：氧化铝、硅胶或离子交换苷类：皂甙、强心甙用硅胶吸附、分配色谱及大孔吸附树脂挥发油、甾体、萜：硅胶或氧化铝吸附色谱黄酮类、鞣质等多元酚：聚酰胺或硅胶吸附色谱有机酸、氨基酸：离子交换、分配色谱、活性炭吸附大分子化合物：蛋白质、多糖用凝胶色谱、大孔吸附树脂各类成分色谱分离可选择吸附剂38*在水中不溶但可膨胀的分离材料是A.葡聚糖凝胶B.氧化铝C.硅胶D.透析膜E.活性炭*凝胶过滤法的洗脱顺序为A.极性小者先洗脱下来B.极性大者先洗脱下来C.分子量大者先洗脱下来D.分子量小者先洗脱下E.羟基数目少者先洗脱下来测试题39*16.高效液相色谱的缩写符号为