长春中医大《中药化学》实验指导

实验报告通过实验将书本上的理论知识运用到实际当中，最终通过写实验报告，总结实验的过程、原理及意义，最终把理论知识用于实践，并通过实验结果补充理论知识真正做到理论和实践相结合，而这一结合的体现是撰写实验报告。根据本课程的特点现将实验报告要求总结如下：一、实验题目——按实验讲义写。二、实验原理——提取、分离、TLC检识的原理分别写。三、实验流程与解析——按实际操作写，解析主要要求说明所操作步骤的原因及注意事项。四、实验步骤——根据实验流程写，并写出注意事项，并表明哪步是自己做的。五、实验结果——产率（计算）、试管反应现象(描述)、薄层图（画或照片，并标示Rf值）六、小结及讨论1、对产率分析：理论应得多少，实际得了多少，并对其进行分析；2、对试管反应现象：解释，并说明可以推测的结果；3、薄层图:对色谱图解释，如色谱原理、展开剂、显色剂，Rf比较。连续回流提取法操作规程一、安装前检查（20分）1.装置组成（各部件名称准确）（1）玻璃仪器部分：三部分组成，烧瓶、索氏提取器（虹吸管、蒸气上升管）、冷凝管（2）固定装置部分：铁架台、双顶丝（自由夹）、万能夹（3）热源：（种类及温度）根据溶剂选热源及控制温度（水浴锅、电热套）（4）其他：滤纸、乳胶管、镊子2.装置是否干净：干净的判断标准（干燥、无水痕）3.装置有无破损（尤其注意磨口处、虹吸管、冷凝管）4.装置是否匹配：索氏提取器部分的大小决定烧瓶大小5.装置是否干燥，若不干燥特别是磨口若不干燥，用乙醇或甲醇或丙酮润洗后吹干或晾干。二、安装设备（20分）1.整体安装位置确定：注意根据热源、冷凝水位置确定具体安装位置及铁架台位置2.玻璃仪器部分从下至上安装，冷凝管斜口对着蒸气上升管3.目测双顶丝和铁架台的位置后，将双顶丝安装在铁架台上，不合适可以微调4.将圆底烧瓶（带有水浴锅保温圈）与万能夹相连，万能夹要固定在圆底烧瓶和索氏提取器的磨口处5.将万能夹固定在铁架台上的双顶丝部分，高度不合适可以微调6.水浴锅水的加入量和加入时间：不要加满，应该在装置安装完毕后补加水，以免烧瓶漂起，加水量为烧瓶三分之二处。7..系统稳定性相关-万能夹的方向一致；重心与铁架台平行8.打开冷凝水之前，要先检查水笼头是否有水，有气，流速大小，以决定提取时冷凝管水流大小。三、滤纸筒填装（20分）1.滤纸包的叠法：原则保证不漏2.滤纸包的高度：应低于蒸汽上升管3.装药量：药材粉碎成粗粉；高度低于虹吸管4.装药后滤纸包封口四、如何加入提取溶剂（20分）1.加入时间：加入滤纸包及冷凝管安装完毕后加入，从冷凝管上方放置漏斗加入。2.加入量：加入溶剂量不少于1个半虹吸量，不超过2个虹吸量（结合烧瓶体积），溶剂量过少难以完成提取，过多增加回收时间，同时受圆底烧瓶体积的限制，注意不同规格装置加入量是不同的。需要根据提供的装置预判加入量，因此需要理解加入量是如何确定的。3.加入位置：从冷凝管加入，用三角漏斗，或从装药筒加入，用三角漏斗：冷凝水打开循环，防止溶剂挥散。4.提取终点的确定方法五、器材整理（20分）1.提取完毕后先关闭水浴锅，再拔下水浴锅电源；待溶剂从冷凝管不滴后再关冷凝水2.拆仪器与安装顺序相反3.滤纸包用镊子夹出后置密闭容器中暂放，待处理。4．取出盛有提取液的烧瓶，用磨口塞或胶皮塞塞上后待回收，防止溶剂挥散到空气中（比赛时如果有时间，可直接利用该装置回收溶剂）5．刷洗玻璃仪器（尤其是虹吸管部分如何涮洗，用少量乙醇洗涤，用蒸馏水冲洗）、晾干、整洁归位。操作考试实例：请完成下列采用连续回流提取部分实验操作穿山龙粗粉（50g）置圆底烧瓶中，加水250ml、浓硫酸20ml，室温浸泡24小时，文火加热回流4~6小时，放冷，倾出酸水液。酸性药渣用清水漂洗3次，然后将药渣倒入乳钵中，加Na2CO3粉末，反复研磨，调pH至中性，水洗，抽干。中性药渣↓低温（80℃）干燥12小时。干燥药渣置乳钵中研成细粉，置索氏提取器中，以石油醚（60~90℃沸程）为溶剂，连续回流提取4~5小时。石油醚提取液回收石油醚至剩10~15ml时，迅速倾入小三角烧瓶中，放置使充分冷却，过滤。↓￣￣￣￣￣￣↓滤液沉淀↓用少量冷石油醚洗二次抽干。薯蓣皂苷元粗品硅胶或聚酰胺薄层检识SOP一、准备工作（20分）1.供试品溶液及对照品溶液制备（1）供试品溶液制备：经提取分离后得到待检识成分，如果是已知化合物，溶解的溶剂选择可根据该化合物的溶解性选择溶剂溶解样品。如果是亲脂性成分（如挥发油、游离的生物碱、香豆素苷元、蒽醌苷元、黄酮苷元），除选择甲醇或乙醇溶解样品，可选择甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯溶解样品制成溶液，但不宜选择沸点较低的乙醚溶解样品；如果是亲水性的成分（苷类化合物），常选择甲醇、乙醇或丙酮溶解样品，但不宜选择沸点较高的正丁醇溶解样品。注意通常不易选择水溶解样品。如果是未知化合物，可参考提取分离过程中选择的溶剂判断。（2）对照品溶液制备：同上。注意事项：样品与对照品要配制成溶液，吸取溶液点样，不要将混浊液或固体物点到薄层板上。溶液制备是影响薄层效果的重要因素。2.仪器与材料的准备（1）薄层板：市售薄层板分普通板和高效薄层板，常用硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理或化学改性，以适应分离要求，可以选择自制薄层板。市售薄层板使用前处理：如需要，硅胶板临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但需注意剪裁后的薄层板底部的硅胶层不得有破损。如存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中保存备用。自制薄层板：①玻板要求：应光滑、平整。用温热洗衣粉水涮洗后、用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗至不附水珠，置干燥洁静处晾干，备用。必要时铺板前用乙醇擦试后铺板。②称取吸附剂（硅胶或硅胶GF254，200‾300目）置乳钵中，按1:3比例加0.3%‾0.5%羧甲基纤维素钠水溶液（或水），在研钵中按同一方向研磨混匀（目的避免产生大量气泡），研磨时间一般不超过4分钟（以研杵沾取有粘稠感），倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度0.3mm和0.5mm），取下涂好薄层的薄板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30分钟，即置有干燥剂（如变色硅胶）的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检查，表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。（2）点样器：①定性和定量微升毛细管；②手动、半自动、全自动点样器材。（3）展开容器：称为展开缸（层析缸）。上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开时用专用的水平展开缸。（4）显色装置：喷雾显色用①玻璃喷雾瓶；②专用喷雾器。采用脚踏式或电动装置压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出。浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。（5）检视装置：装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的亮度。（6）其他：配制展开剂溶剂、电吹风、铅笔、格尺、移液管、分液漏斗、垃圾缸。二、点样（20分）1.实验材料准备：将供试品溶液、对照品溶液、薄层板、点样器（毛细管等）、电吹风、格尺、铅笔摆放在洁净干燥的实验台上，并注意光线、高度及周围环境等是否适合点样，实验者端坐在试验台旁。2.定位：定位用铅笔，不要用其它笔标记位置。预制板或自制板点样基线距底边10mm‾15mm(1cm‾1.5cm)，高效板一般基线距底边8mm‾10mm(0.8cm‾1cm)，具体用铅笔在两侧先确定，然后连接两点成直线，保证点样样品在一条直线上；点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互相不干扰为宜，一般不少于8mm（0.8cm），高效板不少于5mm（0.5cm）；点样圆点状直径一般不大于3mm；高效板不大于2mm；条带状宽度一般为5mm‾10mm(0.5cm‾1cm)；高效板条带状宽度一般为4mm‾8mm(0.4cm‾0.8cm)，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。3.点样注意：①接触点样时注意力度，勿损伤薄层表面；②根据点样量要求，选择合适的毛细管（或其他点样器）一次性将溶液取足量，尤其定量时最好要一次性取量；③根据点样量及圆点大小决定点样次数，如果需要多次点样，应将前次点样溶液用吹风吹干后再次上样，以避免斑点扩散出现复斑或拖尾现象，用电吹风时，先预测一下风力和温度，必要时用凉风，注意将实验台上实验材料吹落或温度过热。4.点样后整理：点样后将毛细管置垃圾缸中，供试品溶液和对照品溶液等实验材料归位放好，再进行展开。三、展开剂配制（20分）1.实验材料准备：①干净和干燥的展开缸，检查是否密闭，如果密闭性差，在边缘涂少许凡士林，注意不要污染层析缸；②不同规格干净及干燥专用移液管；③分析纯溶剂；④如果用展开剂需要分层，则需要干净及干燥的分液漏斗；⑤展开缸的干燥不要用烘箱加热烘干或用热风长时间吹干。2.展开剂取量确定：根据层析缸规格，按比例配制的总量应以将点好的薄层板放入层析缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm（0.5cm）为宜，切记不要浸泡或超过原点。3.展开剂配制：按上述确定取量，用移液管吸取溶剂。如果展开剂不分层[如氯仿-甲醇（8:2）]，吸取后直接放入层析缸中（如果是双槽，放入一侧），迅速密闭，展开剂如果需要饱和，则可以在点样前将展开剂配好静置；如果展开剂分层[如氯仿-甲醇-水（65:35:10）下层]，则应在分液漏斗中配制，分层后取上层或下层。4.预平衡与蒸气饱和：展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量展开剂，密闭，一般保持15‾30分钟，溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则需要展开缸的内侧放置与展开缸内侧放置与展开缸的内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。5.展开：将点好供试品与对照品的薄层板放入展开缸，密闭，上行展开，一般展距8‾15cm，高效薄层板上行展开5‾8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。四、显色（20分）1.日光下检视：有颜色或显色成分后检视：供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。2.紫外光下检视：有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱；对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。五、结果检识1.记录：薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。2.计算Rf值：Rf=斑点中心与原点距离（cm）/原点与前沿的距离（cm，展距），目的判断斑点位置，表示各组成成分的位置。3.斑点颜色描述：（1）置可见光下观察，可见不同颜色斑点；（2）置紫外光灯（365nm）下观察，可见不同颜色的荧光斑点；（3）置紫外光灯（254nm）下观察，可见荧光淬灭斑点（以硅胶GF254为吸附剂）4.结果专业术语描述：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色（或荧光）斑点。六、器材整理（20分）1.展开剂倾入废液缸内，不要倒入下水道或其它地方，通风橱中晾干（必要时刷洗干净）。2.薄层板记录结果后，将硅胶板用水浸湿，刷洗干净，晾干，备用。3.将其他实验器材归位，将垃圾缸中垃圾倒掉。实例1：层析板：自制硅胶-CMC硬板样品：精品总碱氯仿液对照品；氧化苦参碱的氯仿溶液展开剂：氯仿：甲醇：氨水（15：4：0.5）显色剂：改良碘化铋钾试剂实例2：吸附剂：硅胶-CMC薄层板（预制板）样品：5%自制薯蓣皂苷元的乙醇液（点样量3对照品：5%薯蓣皂苷元对照品的乙醇液展开剂：苯：乙酸乙酯（8：2）显色剂：25%磷钼酸的乙醇溶液（喷洒后110℃加热5分钟）实例3：大黄中蒽醌类成分薄层色谱鉴别实例4芦丁和槲皮素薄层色谱