西南林大生物化学仪器分析技术课件-04离心技术2

2·2离心机的类型及主要构造因离心机的转速不同，可分为普通离心机、高速离心机及超速离心机。2·2·1普通离心机普通离心机的最高速度为8000r/min，最大RcF近6000×g。一般速度为4000r/min。2·2·2高速离心机高速离心机可以达到25000r/min的最高速度和89000xg的最大离心力。这类离心机通常带有冷却离心腔的致冷设备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶监测离心腔的温度。其中大容量连续流动离心机的主要用途是从大量培养物(5-500L)中收集酵母及细菌等。另一类是低容量冷冻离心机，型号甚多，其最大容量可达3L。这类离心机有各种内部可变换的角式和甩平式转头，它们多用于收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物、免疫沉淀物和酶的粗提液等。特别需注意的是，每次离心前，应根据样品多少来选择转头型号和设置转速等参数。2·2·3超速离心机超速离心机能超过500000xg的离心力，能便亚细胞器分级分离，可用于分离病毒，也可用于测定蛋白质、核酸的相对分子质量等。主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。(1)驱动和速度控制大多数超速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频马达连接到转头轴构成。由于驱动轴的直径仅仅0·476cm，在旋转期间细轴可有一定的弹性弯曲，以便适应转头的轻度不平衡，而不至于引起震动或转轴损伤。利用变阻器和带有旋速计的控制器来选择转头的转速。除速度控制系统以外，还有一个过速保护系统以防止转速超过转头最大规定转速时引起的转头撕裂或爆炸。为此目的，离心腔总是用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭。(2)温度控制其温度控制是由安置在转头下面的红外线射量感受器直而连续地监测转头的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控。(3)真空系统当转速超过40000r/min时，空气与旋转的转轴之间的摩擦生热成为严重的问题。为了消除这种热源，超速离心机一般增添了真空系统将离心腔密封，并通过两个串联工作的真空泵系统抽成真空。第一个工作泵一般实验室的机械真空泵相同，它可抽真空到13·33-6·66Pa。一且离心腔的压力减低到33·33Pa以下，水冷扩散泵也开始工作。利用这两个泵，可使真度达到并维持在0·13-0·26Pa。在摩擦力降低的情况下，速度才有可能升高所需的转数。(4)转头制备性超速离心机采用的转头有各种各样，一般可分为两大类：角式转头和甩平式转头。角式转头的孔穴与旋转轴心之间的角度在200～450间。这类转头的优点是具有较大的容量，速度较高。另一种甩平式转头，由一个转头上悬吊着6个自由活动的吊桶(离心管套)构成。当转头静止时，这些桶垂直悬挂;当转头在离心力的作用下转速达到200～800r/min时，吊桶即甩到900水平位置。这种转头主要是为了密度梯度沉降法而设计的。其主要优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，而离心时管子保持水平。在水平位沉降到离心管不同区域的样品呈现出横过离心管的带状，而不像角式转头中那样成角度。因此，当从转头中取出离心管时，不会像在角式转头中那样，沉降成分重新定位。这类转头的缺点是:形成区带所需的时间较长。2·3常用离心技术利用离心技术分离制备样品时，常用差速离心法和密度梯度离心法。后者又分速率区带离心和等密度梯度离心。2．3．1差速离心法这个方法基于待测物质颗粒的大小、密度不相同，其沉降速度不一样而得到分离。例如不同的细胞器，因其大小和密度不一致，在不同的转速下得到分离。一般方法如下:向植物材料加入一定量的缓冲液，通过研磨或用组织捣碎器捣碎，滤去残渣(细胞壁及未破碎的细胞)，滤液中含有各种细胞器，在不同的相对离心力作用下可将细胞器一一分开。主要细胞成分的沉降顺序，一般先是整个细胞和“细胞碎片”，然后是核、叶绿体、线粒体、溶酶体(或其他“微体”)“微粒体”（滑面内质网和糙面内质网碎片)和核蛋白体。2·3·2速率区带离心用速率区带离心技术分离样品依赖于样品中粒子或高分子的不同大小和沉降速度。如图1-2-4所示，把一层样品溶液铺于一密度梯度介质液柱的顶部，样品在液柱顶部形成一负梯度，不过底部存在着一个陡的正梯度，防止了样品的过早沉降。离心力作用下粒子在梯度介质中呈分离的区带状沉降，每一条区带粒子的特征是具有同一沉降速度。根据不同的实验目的可以设计不同的连续或不连续梯度。如进行亚细胞组分分离实验时，常采用不连续蔗糖密度梯度法，一般配制的u(蔗糖梯度)是25％、35％、45％、55％。在进行血清、病毒、多核糖体分离实验时，刚采用连续蔗糖密度梯度法，一般使用密度梯度自动混合器，配制的蔗糖梯度为10％～40％。要使速率区带离心得到成功，样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度，并且必须在区带到达离心管底部以前停止离心。2·3·3等密度梯度离心等密度梯度离心是按粒子浮力密度不同而分离的离心方法，为此要选择介质的密度梯度，使梯度的密度范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以铺在密度梯度液柱上面或均匀分布于密度梯度介质中。离心过程中粒子移至它本身相同密度的地方形成区带，因此平衡时它们的分离完全是由于它们之间密的差异，和时间无关。等密度梯度实验中最常用的介质是碱金属的盐溶液，如銫盐或铷盐。实验开始时往往是一密度均一的溶液，在离心过程中“自动”形成梯度。形成梯度过程中，原先均匀分布的样品粒子也下沉或上浮至其等比重位置。这种自生梯度技术需要长时间离心，例如DNA在氯化銫梯度中形成等比重区带需要36～48h。特别要指出的是，离心时间不会因转速增加而减少，提高转速只能使梯度物质重新分布，区带位置有所改变。许多密度梯度实验常常把速率区带和等密度法合并应用。例如选择一个密度梯度使得样品中一部分沉降到离心管底部，而另一部分停留在它的等密度处。