西南林大生物化学仪器分析技术课件-07光学分析技术

光学分析技术•光学分析技术广泛应用于生物化学的各个领域。分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。本章重点介绍紫外光-可见光分光光度法、荧光分光光度法。紫外光和可见光分光光度法•光有不同的波长，肉眼可见的光称为可见光，波长在400-750nm范围;波长小于400nm的光称为紫外光;大于750m的光称为红外光。表1－6－1列出了各种单色光的波长范围。•紫外光-可见光分光光度法是利用分光装置，将光源产生的连续光谱分成含紫外光或可见光的各种单色光，再用单色光照射待测溶液，经检测器接受透过光的强弱，并转换成电信号，从而实现对物质进行定性或定量分析的方法。用于分光光度分析的仪器叫分光光度计。原理•分光光度法依据的原理是朗伯-比耳定律。布格和朗伯阐明了溶液的吸光度与吸收层厚度的比例关系;比耳则提出了光吸收与溶液浓度成正比。当同时考虑两种因素对单色光吸收的影响时，则得到布格-朗伯一比耳定律。习惯上称为朗伯-比耳定律。其数学表达式为:•A=logI0/It=εbc•式中：A为吸光度，I0为入射光强度，It为透射光强度，b为吸收层厚度(cm)，c为吸收物质的量浓度(mol/L),ε为摩尔吸光系数[L/(mol·cm)]。透射光强度(It)的改变与待测溶液浓度(C)和液层厚度(b)有关，并且吸光度（A）与b和c成正比。•分光光度计的基本构造•分光光度计由六部分组成，即光源、单色器、检测器、电子放大器和记录（电脑记录）(图1-6-2)。类型和使用方法介绍•类型很多，越来越先进。双单光路的介绍。•使用方法：开启电源开关，预热；打开样品室盖，可选择T(透光率)或“A”（吸光度）；然后合上样品室盖。可以固定波长检测，也可以选择波长范围扫描。分光光度法的应用•分光光度法广泛应用于动、植物蛋白质、氨基酸、核酸和糖类的定性定量分析、农产品品质分析以及各种酶活性测定等，简介如下。蛋白质含量的测定•利用蛋白质分子中的肽键或特定氨基酸残基的颜色反应，以及其特有的吸收光谱可以进行定性或定量测定。介绍紫外吸收法。•用溶解蛋白质的溶液作为对照。根据待测样的吸光度计算出蛋白质含量。可以用公式法和经验法计算。氨基酸含量的测定•通常利用氨基酸与水合茚三酮反应，定量地生成二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量成正比。糖类含量的测定•用蒸馏水或70%的乙醇抽提样品后，还需要沉淀其中的蛋白质，经过滤或离心后，用上清液进行测定。常用的方法主要有二硝基水杨酸法和裴林试剂比色法测定还原糖，蒽酮比色法和苯酚法测定可溶性糖。核酸含量的测定•核酸的定量测定用A260/A280的比值，作为DNA提取，比值为1.8为好，作为RNA，比值为1.8～2.2。还可以根据A260值来计算核酸的浓度。A260＝1，双链DNA为50μg/mL。酶活力测定•在进行酶活力测定时，常利用酶促反应的底物或产物能吸收不同波长的光来进行测定。