西南林大生物化学仪器分析技术课件-08荧光分光光度法

荧光分光光度法1、原理•基态分子由于吸收特征频率的光能之后被激发。被激发分子中的电子在不到10-15s的时间内由基态跃迁到激发态。激发态电子很不稳定，会迅速降低能量回到第一电子激发态的最低振动能级，然后再从这一能级返回基态的几个振动能级。•激发态电子从第一电子激发态最低振动能级返回基态的几个振动能级的过程中，激发态电子以光的形式放出它们所吸收的能量，所发出的光称为荧光。•荧光物质分子所吸收的特征频率的光称为激发光(excitedlight)。荧光光谱（fluorescencespectrum）在这里就是发射光谱。荧光的激发光谱与发射光谱是荧光分光光度分析的基本参数和依据。荧光物质在吸光之后发射出的荧光强度是最常用的荧光参数之一，它是表示荧光发射强弱的物理量。•目前，一般商品荧光分光光度计都采用荧光强度来表示，单位为任意单位表示的相对强度。荧光物质发射的荧光强度与它吸收的光能成正比。当测量的溶液很稀时，可用如下公式表示:•F=KI0Clε•F为荧光强度；I0为激发光强度；K为仪器常数；C为样品浓度；ε为样品吸光系数；Ф为样品的量子产率；l为样品池光径。•由上式可知，荧光强度与样品吸光系数和量子产率成正比，同时也与样品浓度C和样品池光径l成正比。•量子产率(Ф)的定义是发射量子数与吸收量子数之比。荧光物质的量子产率在一定激发光波长范围内保持恒定。由于荧光强度只是相对强度，只能在同一仪器条件下加以比较，因此，在比较不同物质的荧光强弱时，应当用量子产率来表示。•通常我们设定荧光波长范围进行扫描，不同物质的荧光扫描图是不一样的，相同的物质的荧光扫描图却是一样的。仪器结构•典型的荧光分光光度计基本部件包括激发光源、单色器、荧光样品池、检测器和显示装置(1)光源•荧光分光光度计中应用最广泛的光源是汞蒸汽灯和高压氙弧灯。汞灯有低压灯和高压灯，发射的光谱随灯内蒸汽压力而变。氙弧灯是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温时压力为5Pa，工作压力约为20Pa，能发射250～800nm很强的连续光谱。因点燃时需用20～40kV的高压，以连续点燃为宜，要避免频繁启动。(2)单色器•最常用的单色器是光栅，因经过棱镜色散时光强损失较大，对于同一强度的光源，棱镜的灵敏度没有光栅高，使用波长范围也没有光栅宽。光栅的主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，但可用前置滤光片加以消除。(3)荧光样品池•液池是用石英制造的方形池，四个面都透光，放入池架中时，要用手拿着棱，并规定一个方向，避免透光面被指痕污染或被固定簧片擦坏。(4)检测器、(5)读出装置。•几乎所有的荧光分光光度计都用光电倍增管作为检测器。•读出装置包括数字电压表、记录仪和阴极示波器等。数字电压表用于定量分析，准确方便又便宜；记录仪可用于扫描光谱；阴极示波器的显示速度比记录仪快得多，但好的阴极示波器价格较贵。荧光分光光度法的应用•荧光分析的方法•荧光分析大致可分为直接测定法和间接测定法两种。直接测定法是利用物质的自身荧光来进行测定，而间接测定法是由于许多有机或无机化合物自身不产生荧光或发射的荧光很微弱，无法直接进行测定，只能用间接的方法进行测定。常用的间接测定法有化学反应法、荧光猝灭法和敏化发光法等。荧光分析中的制样技术•(1)溶剂和化学试剂的选择。制样过程所用的溶剂和化学试剂选择要适宜，而且要有足够的纯度，这对荧光分析是非常重要的。如果溶剂在一定波长范围内有吸收，就不宜在此波段用作荧光试剂；同一种荧光在不同溶剂中的荧光强度和荧光光谱都是显著不同的。化学试剂的纯度不高，会带来干扰的杂质。(2)待测液的浓度。•荧光分析是微量组分或痕量组分的分析。下图中的(A)为稀溶液，在入射光I0激发下所产生的荧光以黑点表示，它均匀分布于液池中；(B)为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收产生强荧光，而液池中，后部的荧光体因不易受到入射光的照射使荧光强度大大下降，所以检测器所测到的荧光强度反而降低。应用实例•(1)糖类的荧光分析。用荧光法可测定葡萄糖、乳糖、果糖和麦芽糖等数十种糖类。例如，葡萄糖与腺苷三磷酸(ATP)在己糖激酶作用下生成腺苷二磷酸和葡糖－6-磷酸盐，后者在葡糖-6-磷酸脱氢酶作用下使NADP还原，生成NADPH和葡萄糖磷酸盐。在ATP用量固定的情况下，以35Onm光激发，在450nm处测定NADPH的荧光强度，可间接测定葡萄糖含量，检测限为5μmol/L。(2)色素•生物碱和维生素的测定。可利用色素、生物碱、维生素等具有自身荧光的特性进行定量测定。例如，卟啉是在许多生命活动中起重要作用的一种天然色素，也是构成植物叶绿素a、b、c及血红素和细胞色素的重要基团，它具有很强的荧光，在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度成线性关系。某些生物碱，如喹啉衍生物、吲哚衍生物、奎宁、婴粟碱、麦角碱和芸香碱等，在酸性介质中荧光有增强现象。维生素B1、B2、维生素C等在紫外光照射下会产生荧光，可利用这些特性用荧光分光光度法进行定量测定。•蛋白测定可以类似于指纹图谱使用。