西南林大现代生化仪器分析课件02紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法是在比色法的基础上发展起来的；它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性定量分析及结构分析。所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。电子能级的能量差ΔΕe较大,1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的电子光谱；振动能级的能量差ΔΕv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，为红外光谱或分子振动光谱；转动能级间的能量差ΔΕr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。称为远红外光谱或分子转动光谱；分子能级分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。分子可吸收二个能级之差的能量。hChEEE12－例：5ev能量其相应的波长为：nm248510998.210136.4EhC1015电子能级跃迁所需的能量较大，其能量一般在1-20eV。故产生的吸收光谱主要处于紫外、可见光区（200-780nm），这种分子光谱称为电子光谱或紫外可见光谱。rveEEEEΔΕeΔΕvΔΕr一、紫外可见吸收光谱:由分子价电子能级跃迁而产生的吸收。波长范围：100-800nm.(1)远紫外光区:100-200nm(2)近紫外光区:200-400nm(3)可见光区:400-800nm分子能级：e250300350400nm1234λ电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁;形成带状光谱。紫外可见吸收光谱分子吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱无机化合物的紫外及可见吸收光谱影响紫外可见吸收光谱的因素有机化合物的紫外吸收光谱键电子—形成单键的电子。键电子—形成双键的电子。n电子—未成键的孤对电子。紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，因此，这种吸收光谱决定于分子中价电子分布和结合情况，按分子轨道理论，在有机化合物分子中有几种不同性质的价电子：例：在甲醛分子中有三种电子存在C-H单键：电子。C=O双键：电子。O原子：n电子。COHnH当有机化合物分子中的价电子吸收一定能量后，价电子将跃迁到较高的能级（激发态）。这些跃迁可分成如下4类：1、N—V跃迁：由基态轨道跃迁到反键轨道；包括饱和碳氢化合物中的—，不饱和烯烃中的—跃迁。2、N—Q跃迁：分子中未成键的n电子激发到反键轨道的跃迁，包括n—及n—跃迁。3、N—R跃迁：是键电子逐步激发到各个高能级，最后电离成分子离子的跃迁。4、电荷迁移跃迁：在光能激发下，某化合物的一部分迁移至另一部分而产生的吸收光谱。分子内的轨道能级图为：**nE各种跃迁所需能量不同，其大小顺序为：*n**n*电子跃迁所处的波长范围及强度为：远紫外区近紫外区可见区**n*n*n*(nm)饱和烃：分子中只有单键，只能产生*跃迁，因而一般吸收带在远紫外区。即10-200nm。这类化合物在200-1000nm范围内无吸收带，故在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。当饱和烃中氢原子被O、N、X、S等原子取代时，由于这类原子中有n电子，能发生n*跃迁，使电子跃迁所需能量降低，吸收峰向长波方向移动。例：CH4125-135nmCH3I150-210nmCH2I2292nm能使吸收峰波长向长波方向移动的杂原子基团叫助色团（如：-NH2，-NR2，-OH，-OR，-SR，-Cl，-Br，-I）不饱和脂肪烃主要包含烯烃和共轭烯烃。这些物质的分子内存在着一个或多个像C＝C、C=O、N=N这些含有电子的基团，吸收能量后产生*跃迁。可使这类化合物的最大吸收峰波长移至紫外及可见光区范围内，使物质具有颜色。使物质具有颜色的基团称为生色团（发色团）。共轭烯烃含共轭双键的化合物，由于-共轭效应，生成大键，在键各能级间的距离较近，电子容易激发，所以吸收峰的波长就增加，生色作用加强。如：乙烯max=171nm,丁二烯max=217nm。这种由于共轭双键中*跃迁所产生的吸收带称为K吸收带。K吸收带的特点强度大，摩尔吸光系数通常在10000-200000L/mol.cm之间；吸收峰位置一般处在217-280nm范围内。共轭双键愈多，深色移动愈显著，甚至产生颜色，据此判断共轭双键的存在情况，这是紫外吸收光谱的重要应用。芳香烯烃图中230-270nm处有一系列吸收带，称为苯的精细结构吸收带，亦称为B吸收带。B吸收带B吸收带的产生是由于*跃迁和苯环的振动的重叠引起B吸收带为芳香族化合物的特征吸收带，在苯环上有取代基时，复杂的B吸收带变得简单化，即峰数减少。但吸收强度增加，同时发生深色移动。除此之外，苯在185和204处有两个吸收带，分别称为E1和E2吸收带，也是芳香族化合物的特征吸收带。无机化合物的紫外及可见吸收光谱电荷迁移跃迁当电子从给体外层轨道向受体跃迁时会产生较强的吸收，这样产生的光谱称为电荷迁移光谱。配位场跃迁f电子跃迁-镧系和锕系元素在配体存在下会分裂成几组能量不同的轨道，当吸收能量后能产生f-f跃迁，产生光谱。d电子跃迁-过渡金属元素的五个能级在配体存在下会分裂成两组能量不同的轨道，当吸收能量后能产生d–d电子跃迁，产生光谱。电荷迁移跃迁d电子跃迁d-轨道de室温：影响不大低温：吸收峰红移，峰尖，强度增加高温：谱带变宽，精细结构消失影响因素影响紫外可见吸光光谱的因素许多化合物具有酸性或碱性可离解基团，PH值不同，分子离解形式不一样，其吸收光谱也不一样。同一种物质，溶剂不同，紫外光谱的峰形和最大吸收位置不同。极性溶剂对溶质吸收峰的波长，峰强及形状可能产生影响PH值温度溶剂紫外可见吸收光谱的应用一、紫外可见分光光度计：紫外可见分光光度计可测定的范围：200-1000nm光源：有钨丝灯及氢（氘）灯两种，钨丝灯-可见光区（360-1000nm），氢（氘）灯-紫外区（200-400nm）单色器：使用石英棱镜（或光栅）。吸收池（比色皿）：使用石英制成。检测器：氧化铯光电管-用于625-1000nm，锑铯光电管-用于200-625nm。紫外吸收光谱的应用定性分析：以紫外吸收光谱鉴定有机化合物时，通常是在相同的条件下，比较未知物与已知标准物的紫外光谱图，若两者的谱图相同，则可以认为待测试样与已知化合物具有相同的生色团。利用紫外吸收光谱作定性鉴定时，除对照标准谱外，可参考其吸光系数；不同物质即使紫外吸收光谱一致，但吸光系数是有差异的，如果待测物和标准物的吸收波长相同，吸光系数也相同，则可认为两者是同一物质。纯度检查如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有较强吸收，就可以方便地检出该化合物中的痕量杂质。定量测定单组分测定标准曲线法：配制一系列已知浓度的标准溶液，测定其A值，作A—C图，测定待测液Ax，查图得Cx。标准对比法：已知浓度标准液Cs,测定As；待测液Cx,测定Ax。则sxsxxxssAA.CCLKCA,LKCA多组分定量测定