边缘无浆体MSP5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立

中国农业科学院硕士学位论文边缘无浆体MSP5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立姓名：马米玲申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：罗建勋;殷宏20070601边缘无浆体MSP5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立作者：马米玲学位授予单位：中国农业科学院相似文献(3条)1.学位论文周玉龙奶牛边缘无浆体病PCR诊断方法建立及MSP-5原核表达2007目的：奶牛无浆体病是黑龙江省近几年奶牛经常发生的无名高热病之一，主要发生于5～10月份，常与其他几种类症病相混淆，给临床诊断带来困难。为了对该病进行深入的研究，首先分离鉴定A.marginale地方分离株；建立PCR快速诊断方法，并初步应用于黑龙江省奶牛无浆体病的流行病学调查；利用己鉴定的A.marginale分离株，构建A.marginale主要表面蛋白-5的编码基因(msp5)的原核表达载体，并获取目的蛋白，为无浆体病血清学诊断方法的建立以及亚单位疫苗研究奠定基础。方法：(1)在黑龙江省大庆市、安达市、嫩江市和齐齐哈尔市等地区奶牛场，采集有典型无名高热病病症状奶牛血液样本，用PCR方法扩增A.marginalemsp5基因并克隆测序，把测序结果与兰州株A.marginale以及GenBank中的6株A.marginalemsp5基因序列进行同源性比较，绘制系统进化树，分析其系统发生关系。(2)根据A.marginale高度保守的msp5基因设计一对特异性引物，以兰州株和上述鉴定的A,marginale分离株为参照，建立无浆体病PCR快速诊断方法，应用该方法对黑龙江省部分地区奶牛无浆体病的流行情况进行调查。(3)选择有代表性的Amarginale分离株(Amarginalestr.HQ)为模板，用具有限制性内切酶BamHI与SalI位点的引物扩增msp5编码序列，将目的DNA片段插入到原核表达载体pQE30构建表达质粒pQE30-msp5，转化到.E.coliXLl-Blue后，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE鉴定。融合蛋白用Anti-His-Tag单克隆抗体进行Westernblot鉴定。融合蛋白用电洗脱方法纯化后免疫新西兰雄兔，制备特异性抗血清，与rMSP-5和从病牛血液中纯化的A.marginale分别进行Westernblot鉴定其免疫原性。结果：(1)从临床样本中扩增出来的DNA片段序列与兰州株A.marginalemsp5基因序列同源性均高于99.5％，与GenBank中的6株Amarginalemsp5基因序列同源性均不低于95.8％，从而确定从样本中扩增出的DNA片段是A.marginalemsp5片段。(2)本实验建立的奶牛无浆体病PCR.快速诊断方法与牛巴贝斯焦虫、双芽巴贝斯焦虫、附红细胞体、大肠杆菌和健康牛血液之间无交叉反应，可检测的被感染最少红细胞数约为200个，可用于潜伏期和感染后携带牛的检测。对奶牛无浆体病流行病学调查结果表明，A.marginale是黑龙江省部分地区奶牛无名高热病的病原之一。(3)应用限制性内切酶BamHI与SalI对重组质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定获得pQE30-msp5，用IPTG诱导pQE30-msp5在EcoliXLl-Blue中表达出目的蛋白，与Anti-His-Tag单克隆抗体进行Westernblot鉴定是融合蛋白，rMSP-5免疫新西兰雄兔产生了高效价抗体，在Westernblot中该抗体能与自然的MSP-5发生特异性反应。结论：1、从黑龙江省分离鉴定了4株A.marginale。2、建立了奶牛无浆体病PCR快速诊断方法。3、成功构建了A.marginalemsp5的重组表达载体pQE30-msp5，并在大肠杆菌中高效表达出融合蛋白rMSP-5，该蛋白与野生A.marginaleMSP-5具有相同的抗原性。2.期刊论文周玉龙.侯喜林.朴范泽.ZHOUYu-long.HOUXi-lin.PIAOFan-ze奶牛边缘无浆体病的PCR鉴定-黑龙江八一农垦大学学报2007,19(2)采集黑龙江省齐齐哈尔市、嫩江市、大庆市和安达市奶牛场具有无浆体病症状奶牛血液样本,用PCR方法扩增边缘无浆体msp5基因,然后将扩增的DNA片段克隆测序,并进行同源性分析.结果发现扩增的4个基因序列与标准边缘无浆体(Anaplasma.marginale)同源性均大于99.5%,与Genbank上已发表的边缘无浆体msp5基因序列同源性百份率均不低于95.8%,进而首次从分子水平证实黑龙江省存在奶牛无浆体病.3.学位论文杜凯边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立2007边缘无浆体病和附红细胞体病是影响养牛业的两种主要的寄生虫疾病。两种病的临床表现均表现为贫血、黄疸、食欲不振、消瘦等。边缘无浆体和附红细胞体都是寄生于血液中的寄生虫，染色镜检很难区分，因此本实验室分别建立边缘无浆体和附红细胞体的实验室检测方法用于它们的临床调查。无浆体病(Anaplasmosis)是由边缘无浆体(A.marginle)经蜱传播而引起的一种传染性血液寄生虫病。本病广泛存在于世界各种地理条件之下，本病主要引起牛、羊、鹿等家畜发病，严重的可以致死，牛死亡率可达80％。它是阻碍养牛业发展的几种主要蜱传播疾病中分布最广的一种。本文选取边缘无浆体部分基因构建载体并进行表达，以此表达蛋白为抗原建立边缘无浆体间接ELISA检测方法，用于调查边缘无浆体的流行病学。并为边缘无浆体检测试剂盒的建立奠定基础。根据GenBank公布的边缘无浆体MSP5基因序列(AY714547)设计一对引物，用PCR方法从无菌颈静脉采集姬姆萨染色镜检边缘无浆体为阳性的牛血的DNA模板中扩增MSP5基因582bp的片断。将该片段克隆到原核表达载体pGEX-KG中，构建原核表达载体KG-MSP5，转化BL21，在IPTG的诱导下表达大小约46kD的蛋白。利用BugBusterGSTBind，PurificationKit将其纯化，经Westernblot分析表明，该蛋白具有良好的免疫反应活性。将可溶性表达产物变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法，特异性试验表明其只能特异性地与边缘无浆体反应。与试剂盒(cELISA方法.VMRD，Inc.)同时检测478份临床样品，符合率为98.54％。利用该方法对湖北省、江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大466份临床样品进行调查，结果表明湖北省样品中边缘无浆体阳性率分别为12.89％，而江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大样品中未检测到边缘无浆体。附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议，传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来16SrRNA基因的系统发育分析的结果表明，附红细胞体更接近于支原体(Mycoplasma)。近几年，国内对该病的报道日益增多，它给畜牧业造成巨大的损失。到目前为止，温氏附红细胞体还没有能够纯培养。实验室检测方法也一般以显微镜镜检为主，在红细胞表面或血浆中能看到温氏附红细胞体的存在。但是显微镜镜检的敏感性和特异性较差，而且及易造成假阳性。血清学方法也存在着没有较好的抗原制备方法以及不能区分是否是正在感染虫等局限性。近来，DNA杂交、PCR等实验方法提高了检测方法的灵敏度。为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法，根据本实验室已测得的温氏附红细胞体16SrRNA基因序列(Genbank登陆号为AY946266)，设计一对种特异性引物，建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验表明，此诊断方法只能特异性地扩增温氏附红细胞体的16SrRNA基因序列的特异性片段，检测温氏附红细胞体最低DNA量为1.78fg。利用该方法对湖北省和江苏省温氏附红细胞体感染情况进行了流行病学调查，结果显示阳性感染率分别为10.3％和3.5％，从分子生物学水平证明了温氏附红细胞体在两省的存在。根据临床样品调查结果显示，本文建立的PCR方法比姬姆萨染色镜检准确特异，姬姆萨染色镜检方法易出现假阳性。本文链接：授权使用：上海海事大学(wflshyxy)，授权号：5c28197e-af91-44b2-be05-9dee0015f683下载时间：2010年9月11日