百脉根结瘤因子受体NFR5及其相互作用蛋白的研究

２００７年１２月２００７，２９（４）：３７２－３７６中国油料作物学报Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｏｉｌｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅｓ百脉根结瘤因子受体ＮＦＲ５及其相互作用蛋白的研究陈春芬，朱辉，杨绮，朱浩，张忠明（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉４３００７０）摘要：以豆科植物百脉根的ｍＲＮＡ为模板，利用ＲＴＰＣＲ方法，扩增到１．０ｋｂ结瘤因子受体５（ｎｏｄｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒＮＦＲ５）蛋白激酶结构域的ＤＮＡ片段（牕牊牜５牘牑），并将该片段克隆到酵母双杂交ＢＤ载体ｐＧＢＫＴ７上。通过酵母双杂交技术，筛选接种根瘤菌的百脉根ＡＤｃＤＮＡ酵母双杂交文库，从文库中分离到与牕牊牜５牘牑相互作用的２２１个阳性克隆。从这些阳性克隆酵母中分离ＡＤ质粒经反复验证，对２６个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析。通过ＮＣＢＩ数据库比对分析鉴定出小Ｇ蛋白Ｒｏｐ６等６个与ＮＦＲ５ＰＫ相互作用的不同蛋白，为进一步研究ＮＦＲ５基因的功能和调控机制提供了材料。关键词：酵母双杂交；ＮＦＲ５；小Ｇ蛋白Ｒｏｐ６；百脉根中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：１００７－９０８４（２００７）０４－０３７２－０５┇┄┉┃┈┃┉┇┉┌┉﹨５┃┋┄━┋┃┃┄┊━┉┄┃┈┃━┃┉┇┃┈┊┉┄┃┃├┹┾┿┽┴┫┺┹┸┳┭┿┽ＣＨＥＮＣｈｕｎｆｅｎ，ＺＨＵＨｕｉ，ＹＡＮＧＱｉ，ＺＨＵＨａｏ，ＺＨＡＮＧＺｈｏｎｇｍｉｎｇ（爳牠牃牠牉爦牉牪爧牃牄牗牜牃牠牗牜牪牗牊爛牋牜牏牅牣牓牠牣牜牃牓爩牏牅牜牗牄牏牗牓牗牋牪，爣牣牃牫牎牗牕牋爛牋牜牏牅牣牓牠牣牜牉爺牕牏牤牉牜牞牏牠牪，爾牣牎牃牕４３００７０，爞牎牏牕牃）﹢┈┉┇┉：ＮＦＲ５ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｓｉｇｎａｌｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆＮｏｄｆａｃｔｏｒｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｒｈｉｚｏｂｉａｉｎ爧牗牠牣牞牐牃牘牗牕牏牅牣牞．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ｂｙｕｓｉｎｇｙｅａｓｔｔｗｏｈｙｂｒｉｄａｐｐｒｏａｃｈ，ＡＤｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｏｆ爧．牐牃牘牗牕牏牅牣牞ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄ２２１ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｄｉｆｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎｏｆＮＦＲ５（牕牊牜５牘牑）ａｓａｂａｉｔａｔｐｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＡｆｔｅｒｒｅｔｒａｎｆｏｒｍｅｄａｎｄＸＧａｌａｓｓａｙ，２６ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄ．ＳｉｘｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｍａｌｌＧＰｒｏｔｅｉｎＲｏｐ６ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｂｌａｓｔｓｅａｒｃｈ．ＴｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｐｒｏｐｏｓｅｄｔｏｂｅｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＮＦＲ５．┎┌┄┇┈：Ｙｅａｓｔｔｗｏｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ；ＮＦＲ５；ＳｍａｌｌＧｐｒｏｔｅｉｎＲｏｐ６；爧牗牠牣牞牐牃牘牗牕牏牅牣牞收稿日期：２００７０４１３基金项目：国家自然科学基金（３０５７００５６）作者简介：陈春芬，硕士研究生，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]，[e-mail]通讯作者：张忠明，教授，博士生导师根瘤菌能侵染豆科植物形成根瘤，根瘤中的细菌具有将大气中游离态氮转化成可被植物直接利用的氨，即共生固氮作用。共生固氮作用包含结瘤和固氮两个生物学过程，首先是结瘤（形成共生体），根瘤形成后才能固氮。在共生体形成过程中，由豆科植物产生类黄酮化合物作为信号分子，诱导根瘤菌结瘤基因表达而合成结瘤因子（Ｎｏｄｆａｃｔｏｒ）。结瘤因子作为根瘤菌信号分子反过来作用于寄主植物，引起根毛变形、卷曲，启动植物结瘤过程［１］。目前，在模式豆科植物百脉根中已鉴定出两个根瘤菌结瘤因子受体蛋白基因，即结瘤因子受体５（ｎｏｄｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＦＲ５）和结瘤因子受体１（ＮＦＲ１）。两个基因分别突变都会导致不结瘤植株的产生，说明二者共同参与识别和接受结瘤因子信号［２］。已有的研究结果表明，爧牐牕牊牜５基因编码６００个氨基酸的蛋白，在Ｎ末端含有信号肽序列和３个ＬｙｓＭ结构域，中部含有跨膜结构（ＴＭ），Ｃ末端含有丝氨酸燉苏氨酸激酶结构域，但缺乏通常调节激酶活性的激活环，是一个非典型的丝氨酸燉苏氨酸激酶。而爧牐牕牊牜１编码５８０个氨基酸的蛋白，在Ｎ末端含有信号肽序列和２个ＬｙｓＭ结构域，中部含有跨膜结构，Ｃ末端含有丝氨酸燉苏氨酸激酶结构域，是一个典型的丝氨酸燉苏氨酸激酶［３］。然而，ＮＦＲ５和ＮＦＲ１是以何种方式参与接受和传递结瘤因子信号，是否形成异源二聚体，还有哪些蛋白参与等问题还悬而未决。本研究通过蛋白质与蛋白质间相互作用，利用酵母双杂交技术，筛选与ＮＦＲ５相互作用的蛋白［４］，为进一步揭示ＮＦＲ５的生化功能和作用机制，以及根瘤菌的信号途径的研究提供新的分子依据。１材料与方法．材料ＢＤＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ＆ＳｃｒｅｅｎｉｎｇＫｉｔ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ。ＲＴＰＣＲＫｉｔ购自ＴａＫａＲａ公司。百脉根种子（爧牗牠牣牞牐牃牘牗牕牏牅牞ＭＧ２０）、常规的克隆载体、大肠杆菌菌株等均为本实验室所收藏。引物均由英基公司合成，ＤＮＡ序列由上海英基生物科技有限公司测定。．方法１．２．１植物种子表面灭菌及生长条件百脉根种子（ＭＧ２０）用７０％无水乙醇处理３０ｓ，２％次氯酸钠浸泡８ｍｉｎ，无菌水漂洗７～８次，利用残留的水分进行催种发芽，２２℃避光培养，每天更换新鲜无菌水，待芽长到约２ｃｍ时移栽至细沙（需灭菌）培养，每天浇灌无菌水，待长出第一片真叶时接种根瘤菌，此后每天浇灌无氮植物营养液，２２℃定时光照培养，光照１６ｈ燉ｄ。１．２．２百脉根总ＲＮＡ的抽提及牕牊牜５牘牑的克隆收集接种根瘤菌２～４ｄ的百脉根的根迅速置于液氮并储藏在－８０℃超低温冰箱。抽提ＲＮＡ时，取出并快速置于－２０℃预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉，加入到含有Ｔｒｉｚｏｌ试剂的小管中，按照Ｔｒｉｚｏｌ产品说明抽提总ＲＮＡ。以总ＲＮＡ为模板，利用设计合成牕牊牜５牘牑的引物（上游引物：含爳牃牓Ｉ酶切位点５′ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧ３′，下游引物：５′ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡ３′含爠牅牗爲Ｉ酶切位点），反应条件为：９５℃１０ｍｉｎ后，按下列参数循环３０次，９５℃变性３０ｓ，５６℃复性３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，按照ＴａＫａＲａ公司提供ＲＴＰＣＲ试剂盒说明书进行ＲＴＰＣＲ，扩增出牕牊牜５牘牑ｃＤＮＡ片段，其片段长度为９７５ｂｐ。大量扩增牕牊牜５牘牑ｃＤＮＡ片段，该片段经爠牅牗ＲＩ、爳牃牓Ｉ双酶切后，连接到ｐＧＢＫＴ７质粒的爠牅牗爲Ｉ、爳牃牓Ｉ位点上（ｐＧＢＫＴ７载体已经被爠牅牗ＲＩ，爳牃牓Ｉ双酶切并回收）。连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株并筛选重组质粒ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑。经酶切验证、ＰＣＲ检测和ＤＮＡ测序，确证重组质粒读码框。１．２．３诱饵质粒自激活活性和毒性试验采用ＬｉＡｃ法制备酵母菌株ＡＨ１０９和Ｙ１８７的感受态细胞，将诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑分别转化ＡＨ１０９和Ｙ１８７菌株中，在ＳＤ燉Ｌｅｕ和ＳＤ燉Ｔｒｐ的平板筛选酵母转化子。将Ｙ１８７转化子划线接种于含ＸＧａｌ（８０μｇ燉ｍＬ）的ＳＤ燉Ｔｒｐ选择培养基上，将ＡＨ１０９转化子分别接种于ＳＤ燉Ｈｉｓ燉Ｔｒｐ燉ＸＧａｌ和ＳＤ燉Ａｄｅ燉Ｔｒｐ燉ＸＧａｌ选择培养基上检测报告基因爧牃牅Ｚ的表达。以空载体的酵母转化子ｐＧＢＫＴ７燉Ｙ１８７为阴性对照。同时，分别挑取新鲜的酵母转化子ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑燉Ｙ１８７和空载体ｐＧＢＫＴ７燉Ｙ１８７于ＳＤ燉Ｔｒｐ液体培养基中，３０℃摇床培养１６～２４ｈ，测定ＯＤ６００值，鉴定融合蛋白的毒性。１．２．４筛选百脉根ＡＤｃＤＮＡ文库将含有ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑的酵母菌株Ｙ１８７（爩爛爴α）与含有百脉根ｃＤＮＡ文库的酵母菌株ＡＨ１０９（爩爛爴α）进行有性杂交，其实验过程按ＢＤＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ＆ＳｃｒｅｅｎｉｎｇＫｉｔ提供的方法进行。杂交后的混合液涂布在ＳＤ燉Ｔｒｐ燉Ｌｅｕ燉Ｈｉｓ燉Ａｄｅ选择培养基上，３０℃培养４～６ｄ，挑取直径大于２ｍｍ的菌落点种于含ＸＧａｌ（８０μｇ燉ｍＬ）的选择培养基上，观察杂交子菌落的颜色反应及变蓝的时间。选取在９６ｈ之内显蓝色反应的菌落，以５′ＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣ３′为上游引物，５′ＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡＣＧＡＴＴ３′为下游引物，逐个进行菌落ＰＣＲ，检测文库质粒上的ＤＮＡ片段，初步确定阳性克隆子。１．２．５阳性克隆的验证、测序逐个从初步确定的阳性克隆中分离文库质粒（ｐＧＡＤＴ７ｃＤＮＡ）并导入大肠杆菌ＤＨ５中回收该质粒。经用牀牎牗Ｉ和爠牅牗ＲＩ做双酶切进一步验证后，再转化到酵母菌株ＡＨ１０９中，并与含ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑诱饵质粒的Ｙ１８７菌株进行单个杂交，并在含ＸＧａｌ（８０μｇ燉ｍＬ）选择性培养基上筛选、鉴定。将回转后再次显蓝的阳性克隆酵母质粒插入的ＤＮＡ片段进行测序和Ｂｌａｓｔ分析。１．２．６ＲＴＰＣＲ检测分别收集接种后第２、４、６、８ｄ百脉根的根，同时收集未接种百脉根的根，按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂的说明书分别提取各样品的ＲＮＡ。利用ＲＴＰＣＲ检测小Ｇ蛋白Ｒｏｐ６在百脉根中的表达，４１中国油料作物学报２００７，２９（４）ＲＴ反应按试剂盒说明书进行，ＰＣＲ反应条件为：９５℃１０ｍｉｎ后，９５℃变性３０ｓ，５６℃复性３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，循环３０次，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ｒｏｐ６引物：上游５′ＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＡＧＧ３′，下游５′ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＣＣＴ３′，用百脉根中组成型表达的Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ做参比。２结果与分析．诱饵质粒┅﹩﹣┐┸┰┼┐┺┵的构建利用ＲＴＰＣＲ从百脉根中扩增出结瘤因子受体ＮＦＲ５的编码蛋白激酶ＤＮＡ片段，其长度为９９６ｂｐ。该片段经爠牅牗ＲⅠ和爳牃牓Ⅰ酶切后，克隆到酵母双杂交载体ｐＧＢＫＴ７质粒的爠牅牗ＲⅠ爳牃牓Ⅰ位点上，并与载体上ＤＮＡ结合蛋白结构域（ＢＤ）形成隔合基因。所构建的ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑诱饵质粒图谱见图１Ａ，经爣牏牕牆Ⅲ酶切后电泳检测，呈现出３条带，其大小分别为４．９ｋｂ、１．８７ｋｂ、１．４９ｋｂ（图１Ｂ）。利用牕牊牜５牘牑特异性引物进行ＰＣＲ鉴定，得到一条约１ｋｂ的带（图１Ｃ）。通过ＤＮＡ序列测定，证实诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７牕牊牜５牘牑的读码框正确，与载体上ＢＤ形成融合表达基因。Ａ．ＴｈｅｍａｐｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｃｐＧＢＫＴ７牕牜牊５牘牑，Ｂ．ｐＧＢＫＴ７牕牜牊５牘牑ＤＮＡｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＨｉｎｄⅢ．Ｌａｎｅ１：１ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅ２：ｐｒｏｄｕｃｔｓｄｉｇｅｓｔｅｄｏｆｐＧＢＫＴ７牕牜牊５牘牑，Ｃ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＥ．Ｌａｎｅ１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅ２：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＧＢＫＴ７牕牜牊５牘牑．图重组诱饵质粒┅﹩﹣┐┸┰┼┐┺┵的构建和鉴定﹨．﹤┄┃┈┉┇┊┉┄┃┃┃┉┉┄┃┄┇┄│┃┃┉┅━┈│┅﹩﹣┐┸┰┼┐┺┵．．诱饵质粒毒性及自激活活性鉴定将含有