GB 31658.20-2022 食品安全国家标准 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.050X31658.20—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationofamphenicolsandmetaboliteresiduesinanimalderivedfoodbyliquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodGB20220920发布－－20230201－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB３１６５８􀆰２０—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB３１６５８􀆰２０—２０２２食品安全国家标准动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织,以及鸡蛋、牛奶、羊奶中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试样中残留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺用２％氨化乙酸乙酯溶液提取,正己烷脱脂,氨化乙酸乙酯反萃取,液相色谱Ｇ串联质谱法测定,内标法定量.５　试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５􀆰１　试剂５􀆰１􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯.５􀆰１􀆰２　乙腈(CH３CN):色谱纯.５􀆰１􀆰３　氨水(NH３􀅰H２O).５􀆰１􀆰４　乙酸乙酯(C４H８O２).５􀆰１􀆰５　无水硫酸钠(Na２SO４).５􀆰１􀆰６　氯化钠(NaCl).５􀆰１􀆰７　甲酸铵(HCOONH４).５􀆰１􀆰８　正己烷(C６H１４).５􀆰２　溶液配制５􀆰２􀆰１　２％氨化乙酸乙酯溶液:取氨水２０mL,用乙酸乙酯稀释至１０００mL.５􀆰２􀆰２　４％氯化钠溶液:取氯化钠４g,用水溶解并稀释至１００mL.５􀆰２􀆰３　４％氯化钠饱和的正己烷:取４％氯化钠溶液适量,加入过量的正己烷,混合,静置分层,取上层正己烷.５􀆰２􀆰４　２０％甲醇溶液:取甲醇２０mL,用水稀释至１００mL.１GB３１６５８􀆰２０—２０２２５􀆰２􀆰５　１０mmol/L甲酸铵溶液:取甲酸铵０􀆰６３g,用水溶解并稀释至１０００mL.５􀆰３　标准品氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺,含量均≥９９％,氯霉素ＧD５、甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３内标,含量均≥９８％,具体见附录A.５􀆰４　标准溶液制备５􀆰４􀆰１　标准储备液:取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准品各适量(相当于各活性成分约１０mg),精密称定,分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至１００mL容量瓶中,配制成浓度为１００μg/mL的标准储备液.－１８℃以下保存,有效期１２个月.５􀆰４􀆰２　内标储备液:取氯霉素ＧD５、甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３内标各适量(相当于各活性成分约１mg),精密称定,分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至１０mL容量瓶中,配制成浓度为１００μg/mL的内标储备液.－１８℃以下保存,有效期１２个月.５􀆰４􀆰３　混合标准中间液:分别精密量取氯霉素标准储备液０􀆰１mL,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准储备液各０􀆰５mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素浓度为１μg/mL,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为５μg/mL混合标准中间液.－１８℃以下保存,有效期３个月.５􀆰４􀆰４　混合内标中间液:分别精密量取氯霉素ＧD５内标储备液０􀆰１mL,甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３内标储备液各０􀆰５mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素ＧD５浓度为１μg/mL,甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３浓度为５μg/mL混合内标中间液.－１８℃以下保存,有效期３个月.５􀆰４􀆰５　混合内标工作液:取混合内标中间液,用２０％甲醇溶液稀释成氯霉素ＧD５浓度为１０ng/mL,甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３浓度为５０ng/mL混合内标工作液,现配现用.５􀆰５　材料尼龙微孔滤膜:０􀆰２２μm.６　仪器和设备６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI).６􀆰２　天平:感量０􀆰００００１g和０􀆰０１g.６􀆰３　均质机.６􀆰４　涡旋混合器.６􀆰５　多管涡旋振荡器.６􀆰６　高速冷冻离心机:转速可达８０００r/min.６􀆰７　氮吹仪.７　试样的制备与保存７􀆰１　试样的制备７􀆰１􀆰１　肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并均质.a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;b)　取均质后的空白样品,作为空白试样;c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.７􀆰１􀆰２　奶取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶或羊奶,混合均匀.a)　取混合均匀后的供试样品,作为供试试样;b)　取混合均匀后的空白样品,作为空白试样;２GB３１６５８􀆰２０—２０２２c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.７􀆰１􀆰３　鸡蛋取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋,去壳,并均质.a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;b)　取均质后的空白样品,作为空白试样;c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.７􀆰２　试样的保存－１８℃以下保存.８　测定步骤８􀆰１　提取取试料２g(准确至±０􀆰０５g),置于５０mL离心管中,加混合内标工作液１００μL,涡旋混匀,再加２％氨化乙酸乙酯溶液１０mL(牛奶、羊奶样品需另加无水硫酸钠３g),涡旋３０s,涡旋振荡１０min,８０００r/min离心５min.上清液转入另一５０mL离心管中,残渣中加２％氨化乙酸乙酯溶液１０mL,重复提取一次.合并两次提取液,于５０℃氮气吹干,待净化.８􀆰２　净化取待净化残渣,加４％氯化钠溶液３mL,涡旋使溶解,再加４％氯化钠饱和的正己烷５mL,涡旋３０s,８０００r/min离心５min,弃去上层正己烷层,用４％氯化钠饱和的正己烷重复脱脂一次.加２％氨化乙酸乙酯溶液５mL,涡旋振荡５min,８０００r/min离心５min,取上层有机相.用２％氨化乙酸乙酯溶液５mL重复萃取一次,合并有机相,５０℃氮气吹干,加２０％甲醇溶液１􀆰０mL,涡旋３０s,过０􀆰２２μm滤膜,供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.８􀆰３　标准曲线的制备精密量取混合标准中间液和混合内标工作液适量,用２０％甲醇溶液稀释,配制成氯霉素浓度分别为０􀆰２μg/L、０􀆰５μg/L、１μg/L、２μg/L、５μg/L、１０μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度分别为１μg/L、２􀆰５μg/L、５μg/L、１０μg/L、２５μg/L、５０μg/L,氯霉素ＧD５浓度均为１μg/L,甲砜霉素ＧD３、氟苯尼考ＧD３、氟苯尼考胺ＧD３浓度均为５μg/L的系列标准溶液,临用现配,供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.以定量离子峰面积比为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线,求回归方程和相关系数.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件a)　色谱柱:C１８色谱柱(１００mm×２􀆰１mm,１􀆰７μm),或相当者;b)　柱温:３０℃;c)　进样量:５μL;d)　流速:０􀆰３mL/min;e)　流动相:A为１０mmol/L甲酸铵溶液;B为乙腈;梯度洗脱程序见表１.表１　梯度洗脱程序时间,min１０mmol/L甲酸铵溶液,％乙腈,％０９８２０􀆰５９８２３􀆰５４０６０４９８２５９８２８􀆰４􀆰２　质谱参考条件a)　离子源:电喷雾离子源;b)　扫描方式:正离子扫描/负离子扫描;３GB３１６５８􀆰２０—２０２２c)　检测方式:多反应离子监测(MRM);d)　脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体;e)　喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度;f)　待测物离子源、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值见表２.表２　待测物离子源、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值药物离子源定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV氯霉素ESI－３２１􀆰１＞１５１􀆰９３２１􀆰１＞２５７􀆰０３２１􀆰１＞１５１􀆰９４８１８１０甲砜霉素ESI－３５４􀆰１＞１８５􀆰０３５４􀆰１＞２９０􀆰０３５４􀆰１＞１８５􀆰０４８２０１２氟苯尼考ESI－３５６􀆰１＞１８５􀆰０３５６􀆰１＞３３６􀆰０３５６􀆰１＞３３６􀆰０５０１８８氟苯尼考胺ESI＋２４８􀆰２＞１３０􀆰３２４８􀆰２＞２３０􀆰１２４８􀆰２＞２３０􀆰１２６２０１０氯霉素ＧD５ESI－３２６􀆰１＞１５６􀆰９３２６􀆰１＞１５６􀆰９４６１８甲砜霉素ＧD３ESI－３５７􀆰２＞２９３􀆰０３５７􀆰２＞２９３􀆰０４８１０氟苯尼考ＧD３ESI－３５９􀆰２＞３３９􀆰０３５９􀆰２＞３３９􀆰０２２６氟苯尼考胺ＧD３ESI＋２５１􀆰２＞２３３􀆰１２５１􀆰２＞２３３􀆰１１８１２８􀆰４􀆰３　测定法８􀆰４􀆰３􀆰１　定性测定在同样测试条件下,试料溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间与标准工作液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间相对偏差在±２􀆰５％以内,且检测到的相对离子丰度,应当与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致.其允许偏差应符合表３要求.表３　定性确证时相对离子丰度的允许偏差单位为百分号相对离子丰度允许偏差＞５０±２０２０~５０±２５１０~２０±３０≤１０±５０８􀆰４􀆰３􀆰２　定量测定取试料溶液和相应的标准溶液,作单点或多点校准,按内标法以色谱峰面积比定量.标准溶液及试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物与其相应内标峰面积比均应在仪器检测的线性范围内.对于残留量超出仪器线性范围的,在提取时根据药物浓度相应增加内标工作液的添加量,使试样溶液稀释后酰胺醇类药物及其代谢物的浓度在曲线范围之内,对应内标浓度与标准工作液一致.标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.８􀆰５　空白试验取空白试料,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行测定.９　结果计算和表述试样中酰胺醇类药物及其代谢物的残留量按标准曲线或公式(１)计算.X＝Cs×Cis×Ai×A′is×VC′is×As×Ais×m(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:X———试样中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);４GB３１６５８􀆰２０—２０２２Cis———试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);Cs———标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);C′is———标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);Ai———试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积;Ais———试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积;As———标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积;A′is———标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积;V———溶解残渣的２０％甲醇溶液体积的数值,单位为毫升(mL);m———试样质量的数值,单位为克(g).１０　方法灵敏度、准确度和