GBT 38505-2020 转基因产品通用检测方法

书书书犐犆犛０７．０８０犃４０!#$%&’’()*犌犅／犜３８５０５—２０２０!#$%&’()*+犌犲狀犲狉犪犾犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊狅犳犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱狆狉狅犱狌犮狋狊２０２００３０６,-２０２００３０６./’(+,-./012’()*3/0456,-书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、深圳市易瑞生物技术股份有限公司、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心、吉林省农业科学院、上海市计量测试技术研究院、甘肃省商业科技研究所有限公司。本标准主要起草人：付伟、王晨光、朱鹏宇、杜智欣、魏霜、朱海、洪霞、郑秋月、付辉、何海宁、李飞武、金虹、安小苹、朱水芳、马涛、刘刚、杨光瑞、曹际娟、袁顺捷、黄文胜。Ⅰ犌犅／犜３８５０５—２０２０转基因产品通用检测方法１　范围本标准规定了转基因产品的定性检测方法。本标准适用于水稻、玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光ＰＣＲ通用检测。本标准方法的最低检出限为０．１％（质量分数）。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．１　转基因产品检测　通用要求和定义ＧＢ／Ｔ１９４９５．３　转基因产品检测　核酸提取纯化方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．７　转基因产品检测　抽样和制样方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１　１８犛狉犚犖犃基因　１８犛狉犚犖犃犵犲狀犲转录自１８ＳｒＤＮＡ，细胞核糖体的组分之一，作为植物内源基因。３．２　犆犪犕犞３５犛启动子　３５犛狆狉狅犿狅狋犲狉犳狉狅犿犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊来自花椰菜花叶病毒（犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊，ＣａＭＶ）的３５Ｓ启动子。３．３　犆犪犕犞３５犛终止子　３５犛狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉犳狉狅犿犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊来自花椰菜花叶病毒（犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊，ＣａＭＶ）的３５Ｓ终止子。３．４　犖犗犛终止子　狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狀狅狆犪犾犻狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲来自胭脂碱合成酶基因的终止子。３．５犈９终止子　狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狉犻犫狌犾狅狊犲１，５犫犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲狊犿犪犾犾狊狌犫狌狀犻狋来自豌豆核酮糖１，５二磷酸羧化酶小亚基（ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔ）基因的３′端终止序列。３．６狆犪狋基因　狆犺狅狊狆犺犻狀狅狋犺狉犻犮犻狀犪犮犲狋狔犾狋狉犪狀狊犱犲狉犪狊犲犵犲狀犲来自绿产色链霉菌（犛狋狉犲狆狋狅犿犮犲狊狏犻狉犻犱狅犮犺狉狅犿狅犵犲狀犲狊），编码膦丝菌素乙酰转移酶（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ１犌犅／犜３８５０５—２０２０ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｄｅｒａｓｅ，ＰＡＴ）。　　注：狆犪狋基因对除草剂草甘膦（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）具有耐受性。３．７犘犻狀Ⅱ终止子狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犻狀犺犻犫犻狋狅狉Ⅱ来自马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒⅡ，犘犻狀Ⅱ）的终止子。３．８犚犫犮犛４启动子　狆狉狅犿狅狋犲狉狅犳狉犻犫狌犾狅狊犲１，５犫犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲狊犿犪犾犾狊狌犫狌狀犻狋１犃来自拟南芥核酮糖１，５二磷酸羧化酶／加氧酶小亚基１Ａ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔ１Ａ，犚犫犮犛４）编码基因的启动子。３．９犇犃犛４０２７８５′边界序列　５′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犇犃犛４０２７８ＤＡＳ４０２７８转化体外源插入片断５′端与玉米基因组的连接区序列。　　注：该序列包括外源插入片段的部分载体序列和玉米基因组的部分序列。３．１０犇犘３０５４２３３′边界序列　３′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犇犘３０５４２３ＤＰ３０５４２３转化体外源插入片断３′端与大豆基因组的连接区序列。　　注：该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列。３．１１犆犞１２７５′边界序列　５′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犆犞１２７ＣＶ１２７转化体外源插入片断５＇端与大豆基因组的连接区序列。　　注：该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列。３．１２犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。４　试剂与材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．１　实时荧光犘犆犚预混液采用经验证符合实时荧光ＰＣＲ要求的实时荧光ＰＣＲ预混液。４．２　５００犿犿狅犾／犔乙二胺四乙酸二钠溶液（狆犎８．０）称取１８．６ｇ乙二胺四乙酸二钠，加入７０ｍＬ水中，并用ＮａＯＨ溶液调ｐＨ值至８．０，加水定容至１００ｍＬ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍｉｎ。４．３　１犿狅犾／犔三羟甲基氨基甲烷盐溶液（狆犎８．０）称取１２１．１ｇ三羟甲基氨基甲烷溶解于８００ｍＬ水中，用盐酸调ｐＨ值至８．０，加水定容至１０００ｍＬ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍｉｎ。４．４　犜犈缓冲液（狆犎８．０）分别量取１０ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ三羟甲基氨基甲烷盐溶液（４．３）和２ｍＬ５００ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠溶液（４．２），加水定容至１０００ｍＬ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍｉｎ。２犌犅／犜３８５０５—２０２０４．５　引物和探针内源和外源基因或元件检测引物和探针序列见表１。引物和探针用ＴＥ缓冲液或双蒸水稀释，稀释浓度见表１。探针的５′端标记荧光报告基团（如ＦＡＭ、ＨＥＸ等），３′端标记荧光淬灭基团（如ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１等）。表１　引物和探针信息表靶标引物名称序列（５′３′）稀释终浓度／（ｎｍｏｌ／Ｌ）目的片段大小／ｂｐ１８ＳｒＲＮＡ内源基因上游引物ＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＴ４００下游引物ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＴ４００探针ＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴ２００１３７ＣａＭＶ３５Ｓ启动子上游引物ＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣ４００下游引物ＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＡ４００探针ＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣ２００９５ＣａＭＶ３５Ｓ终止子上游引物ＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＴＣ４００下游引物ＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＡ４００探针ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴ２００１０１犖犗犛终止子上游引物ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧ４００下游引物ＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＡＴＡＴＴＴ４００探针ＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＣＧ２００９７狆犪狋基因上游引物ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧ４００下游引物ＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＧ４００探针ＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＣ２００１１９犘犻狀Ⅱ终止子上游引物ＧＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＧＧ４００下游引物ＣＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＴ４００探针ＡＧＴＧＡＴＴＡＧＣＡＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＣ２００１０５犈９终止子上游引物ＴＣＴＴＧＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴ４００下游引物ＧＧＡＣＣＡＴＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣ４００探针ＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧ２００１０８犚犫犮犛４启动子上游引物ＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣ４００下游引物ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＴＡＴＣ４００探针ＡＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＣ２００１１２ＤＡＳ４０２７８５′边界序列上游引物ＣＡＣＧＡＡＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＴＣ４００下游引物ＴＧＧＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧ４００探针ＣＧＴＡＧＣＴＡＡＣＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＣＣＧ２００８８３犌犅／犜３８５０５—２０２０表１（续）靶标引物名称序列（５′３′）稀释终浓度／（ｎｍｏｌ／Ｌ）目的片段大小／ｂｐＤＰ３０５４２３３′边界序列上游引物ＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧＧＣＴＡＧＣ４００下游引物ＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡ４００探针ＴＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡ２００９３ＣＶ１２７５′边界序列上游引物ＡＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＧＡＣ４００下游引物ＣＡＴＴＣＧＴＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＧＴＧＴＡＣ４００探针ＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＣＣ２００９８　　对于不明确是否为转基因产品的样品，应选用上述所有内源和外源基因进行检测。对于确定物种的转基因样品，应根据表２选用基因或元件进行检测。表２　确定物种选用基因或元件物种选用基因／元件大豆及其加工产品内源基因、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、犖犗犛终止子、狆犪狋基因、犘犻狀Ⅱ终止子、犈９终止子、犚犫犮犛４启动子、ＤＰ３０５４２３３′边界序列、ＣＶ１２７５′边界序列玉米及其加工产品内源基因、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＣａＭＶ３５Ｓ终止子、犖犗犛终止子、狆犪狋基因、犘犻狀Ⅱ终止子、ＤＡＳ４０２７８５′边界序列油菜及其加工产品内源基因、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＣａＭＶ３５Ｓ终止子、犖犗犛终止子、犈９终止子、犘犻狀Ⅱ终止子水稻及其加工产品内源基因、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＣａＭＶ３５Ｓ终止子、犖犗犛终止子马铃薯及其加工产品内源基因、犖犗犛终止子、犚犫犮犛４启动子苜蓿及其加工产品内源基因、犖犗犛终止子、犈９终止子甜菜及其加工产品内源基因、犈９终止子５　仪器与设备５．１　分析天平：感量０．１ｍｇ。５．２　生物安全柜。５．３　实时荧光ＰＣＲ仪。５．４　纯水仪。５．５　涡旋振荡仪。５．６　微量移液器。６　操作步骤６．１　抽样按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．１和ＧＢ／Ｔ１９４９５．７的规定执行。４犌犅／犜３８５０５—２０２０６．２　制样按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．１和ＧＢ／Ｔ１９４９５．７的规定执行。６．３　试样预处理按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．１和ＧＢ／Ｔ１９４９５．３的规定执行。６．４　犇犖犃模板制备按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．１和ＧＢ／Ｔ１９４９５．３的规定执行。或可采用具有相同效果的植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行ＤＮＡ模板制备。６．５　犇犖犃浓度测定采用紫外分光光度法测定ＤＮＡ浓度，将ＤＮＡ溶液做适当的稀释，于２６０ｎｍ处测定其吸光度，根据测定的ＯＤ值计算ＤＮＡ浓度（２６０ｎｍ处１ＯＤ＝５０μｇ／ｍＬ双链ＤＮＡ），ＯＤ值应该在０．２～０．８的范围内。于２８０ｎｍ处测定其吸光度，根据测定的ＯＤ值计算ＤＮＡ溶液的ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ比值，比值应在１．８～２．０。６．６　实时荧光犘犆犚检测６．６．１　阴性对照、阳性对照和空白对照的设置以非转基因样品为阴性对照，以对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样品基因组ＤＮＡ，或含有上述片段的质粒标准分子ＤＮＡ为阳性对照，以水或ＴＥ缓冲液为空白对照。６．６．２　实时荧光犘犆犚反应体系ＰＣＲ反应体系见表３或按照经验证符合要求的试剂盒推荐体系进行配制。每个ＤＮＡ样品做２个平行管。加样时应使样品ＤＮＡ溶液完全加入反应液中，不要黏附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。表３　实时荧光犘犆犚反应体