GB 5009.285-2022 食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定

书书书　　!#$%&’’()*犌犅５００９．２８５—２０２２!#$%&’(!)*+,犅１２-./２０２２０６３０01２０２２１２３０23!#$%&’’(+,-./01’(2345678901书书书犌犅５００９．２８５—２０２２１　　　　前　　言　　本标准代替ＧＢ５４１３．１４—２０１０《食品安全国家标准　婴幼儿食品和乳品中维生素Ｂ１２的测定》。本标准与ＧＢ５４１３．１４—２０１０相比，主要变化如下：———增加了第一法液相色谱法；———增加了第二法液相色谱质谱法；———删除了规范性引用文件；———修改了原微生物法为第三法。犌犅５００９．２８５—２０２２１　　　　食品安全国家标准食品中维生素犅１２的测定１　范围本标准规定了食品中维生素Ｂ１２的测定方法。第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素Ｂ１２的测定。第二法液相色谱质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素Ｂ１２的测定。第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素Ｂ１２的测定。第一法　液相色谱法２　原理试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和５脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。３　试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１　试剂３．１．１　无水乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。３．１．２　乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。３．１．３　甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱级。３．１．４　乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱级。３．１．５　三氟乙酸（ＣＦ３ＣＯＯＨ）：色谱级。３．１．６　氰化钾或氰化钠（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。３．１．７　胃蛋白酶（ＣＡＳ号：９００１７５６，活力≥４００Ｕ／ｍｇ）。３．１．８　淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。３．１．９　乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。３．２　试剂配制３．２．１　乙醇溶液（２５％）：量取２５０ｍＬ乙醇，加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。３．２．２　乙酸钠缓冲液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：称取２０．５ｇ无水乙酸钠，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸调ｐＨ至４．０±０．１，用水稀释至１０００ｍＬ。犌犅５００９．２８５—２０２２２　　　　３．２．３　氰化钾（或氰化钠）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：称取１．０ｇ氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至１００ｍＬ。注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。３．２．４　三氟乙酸溶液（０．０４％，体积比）：量取５００ｍＬ水，加入２００μＬ三氟乙酸，混匀。３．３　标准品维生素Ｂ１２（氰钴胺素）标准品（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ号：６８１９９）：纯度≥９９％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。３．４　标准溶液配制３．４．１　维生素Ｂ１２标准储备液（１ｍｇ／ｍＬ）：称取１０ｍｇ（精确至０．０１ｍｇ）维生素Ｂ１２标准品于５０ｍＬ烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于－２０℃下避光保存，有效期６个月。３．４．２　维生素Ｂ１２标准工作液（１０μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准储备液，置于１００ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期１个月。３．４．３　维生素Ｂ１２标准系列工作溶液：准确吸取标准工作液３０μＬ、６０μＬ、９０μＬ、１５０μＬ和２００μＬ，分别置于１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。其浓度分别为：３０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ和２００ｎｇ／ｍＬ。临用现配。３．５　材料３．５．１　维生素Ｂ１２免疫亲和柱，柱容量≥８００ｎｇ，柱回收率≥８５％（验证方法参见附录Ａ）。３．５．２　玻璃纤维滤纸。３．５．３　微孔滤膜：水相，０．２２μｍ。４　仪器和设备４．１　液相色谱仪：带紫外检测器。４．２　天平：感量为０．０１ｇ、０．００１ｇ和０．００００１ｇ。４．３　ｐＨ计：精度０．０１。４．４　水浴恒温振荡器：温度范围２５℃～１００℃。４．５　超声波清洗器。４．６　离心机：转速≥１００００ｒ／ｍｉｎ。５　分析步骤注：操作过程应避免紫外光照，并尽可能避光操作。５．１　样品前处理５．１．１　试样制备固体样品粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。犌犅５００９．２８５—２０２２３　　　　５．１．２　样品提取称取５ｇ～１０ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于１５０ｍＬ具塞锥形瓶中，依次加入３０ｍＬ乙酸钠缓冲液、０．２ｇ胃蛋白酶、０．０５ｇ淀粉酶和２ｍＬ氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在３７℃，酶解３０ｍｉｎ（肉类样品酶解１０ｈ～１６ｈ），酶解后转入１００℃水浴中，保持３０ｍｉｎ，取出冷却至室温。将样品溶液转移至１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液４０ｍＬ至５０ｍＬ离心管中，在１００００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。５．１．３　净化将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，移取适量上述滤液（其中含维生素Ｂ１２为１０ｎｇ～５００ｎｇ）过柱，调节过柱速度为２ｍＬ／ｍｉｎ～３ｍＬ／ｍｉｎ。待样液完全过柱后，用１０ｍＬ水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置１０ｍＬ玻璃试管，用３ｍＬ甲醇分３次洗脱，收集全部洗脱液，在６０℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用０．０４％三氟乙酸溶液定容至１．０ｍＬ，涡旋３０ｓ溶解残留物，０．２２μｍ滤膜过滤，待测。注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节ｐＨ＞１０，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的３％加入），使氰化物分解，放置２４ｈ后排放。５．２　液相色谱参考条件５．２．１　色谱柱：Ｃ１８柱（柱长１５０ｍｍ，柱内径４．６ｍｍ，填料粒径２．５μｍ），或相当者。５．２．２　流动相：Ａ相，０．０４％三氟乙酸溶液；Ｂ相，乙腈。５．２．３　梯度洗脱：０ｍｉｎ～６．０ｍｉｎ，９０％Ａ；６．０ｍｉｎ～８．５ｍｉｎ，９０％～０％Ａ；８．５ｍｉｎ～１４．０ｍｉｎ，９０％Ａ。５．２．４　流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。５．２．５　柱温：４０℃。５．２．６　进样体积：１００μＬ。５．２．７　检测波长：３６１ｎｍ。５．３　标准曲线的制作将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素Ｂ１２的峰面积为纵坐标，以维生素Ｂ１２的浓度为横坐标绘制标准曲线。液相色谱图见附录Ｂ中图Ｂ．１。５．４　样品测定将待测样液注入液相色谱仪中，得到待测溶液中维生素Ｂ１２的峰面积，根据标准曲线得到测定液中维生素Ｂ１２的浓度。待测样液中维生素Ｂ１２的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释上机溶液，或调整取样量重新按样品分析步骤处理后再进样分析。５．５　空白试验不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。６　分析结果的表述试样中维生素Ｂ１２（以氰钴胺素计）的含量按式（１）计算：犌犅５００９．２８５—２０２２４　　　　犡＝ρ×犞１×犞３×１００犿×犞２×１０００……………………（１）　　式中：犡　———试样中维生素Ｂ１２的含量，单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ）；ρ———由标准曲线得到的试样溶液中维生素Ｂ１２的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞１———样品提取液的定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞３———试样过柱洗脱液的最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；１００———换算系数；犿———试样的取样量，单位为克（ｇ）；犞２———上柱溶液的体积，单位为毫升（ｍＬ）；１０００———换算系数。计算结果保留两位有效数字。７　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。８　其他当取样量为５．００ｇ时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品的检出限为０．２μｇ／１００ｇ，定量限为０．５μｇ／１００ｇ。第二法　液相色谱质谱法９　原理试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和５脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。１０　试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。１０．１　试剂１０．１．１　无水乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。１０．１．２　氢氧化钠（ＮａＯＨ）。１０．１．３　乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。１０．１．４　乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。１０．１．５　乙酸铵（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）：色谱纯。１０．１．６　氰化钾或氰化钠（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。１０．１．７　胃蛋白酶（ＣＡＳ号：９００１７５６，活力≥４００Ｕ／ｍｇ）。犌犅５００９．２８５—２０２２５　　　　１０．１．８　淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。１０．１．９　乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。１０．２　试剂配制１０．２．１　乙醇溶液（２５％）：量取２５０ｍＬ乙醇，加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。１０．２．２　乙酸钠缓冲液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：称取２０．５ｇ无水乙酸钠，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸调ｐＨ至４．０±０．１，用水稀释至１０００ｍＬ。１０．２．３　氰化钾（或氰化钠）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：称取１．０ｇ氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至１００ｍＬ。注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品，操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。１０．２．４　氢氧化钠溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：称取４．０ｇ氢氧化钠，加适量水溶解，并用水稀释至１００ｍＬ。１０．２．５　乙酸铵溶液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．１９ｇ乙酸铵，加适量水溶解，并用水稀释至１０００ｍＬ。１０．２．６　乙腈溶液（９０％，体积比）：量取１００ｍＬ水加于９００ｍＬ乙腈中，混匀，超声脱气。１０．３　标准品１０．３．１　维生素Ｂ１２（氰钴胺素）标准品（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ号：６８１９９）：纯度≥９９％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。１０．３．２　维生素Ｂ１２同位素内标溶液（１３Ｃ７Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ）：１μｇ／ｍＬ甲醇溶液。１０．４　标准溶液配制１０．４．１　维生素Ｂ１２标准储备溶液（１ｍｇ／ｍＬ）：称取１０ｍｇ（精确至０．０１ｍｇ）维生素Ｂ１２标准品于５０ｍＬ烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于－２０℃下避光保存，有效期６个月。１０．４．２　维生素Ｂ１２标准中间溶液（１０μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准储备溶液，置于１００ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期１个月。１０．４．３　维生素Ｂ１２标准工作溶液（０．２μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准中间溶液，置于５０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期一周。１０．４．４　维生素Ｂ１２同位素内标工作液（５０ｎｇ／ｍＬ）：吸取０．５ｍＬ维生素Ｂ１２同位素内标溶液（１μｇ／ｍＬ），置于１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存。１０．４．５　标准系列溶液：分别准确移取０．２μｇ／ｍＬ的维生素Ｂ１２标准工作溶液１０μＬ、２５μＬ、５０μＬ、１２５μＬ、２５０μＬ和５００μＬ于１ｍＬ容量瓶中，各加入１００μＬ同位素内标工作液（５０ｎｇ／ｍＬ），用水定容至刻度，摇匀。其中，维生素Ｂ１２的浓度分别为２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ和１００ｎｇ／ｍＬ。维生素Ｂ１２同位素内标的浓度为５ｎｇ／ｍＬ。临用现配。１０．５　材料１０．５．１　维生素Ｂ１２免疫亲和柱