SNT 5528-2022 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5528—2022大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofBarleystripemosaicvirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、广东杰信检验认证有限公司、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人:冯黎霞、魏霜、李献锋、于璇、武目涛、赵立荣、黄璐、于翠、杨翠云。ⅠSN/T5528—2022学兔兔、普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检疫鉴定方法。本文件适用于籽粒、花粉、种苗及其他植物产品中大麦条纹花叶病毒的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4大麦条纹花叶病毒基本信息学名:Barleystripemosaicvirus。异名:Barleyfalsestripevirus,Barleymildstripevirus,Barleymildstripemosaicvirus,Barleymosaicvirus,Barleystripemosaichordeivirus,Oatstripemosaicvirus。缩写:BSMV。分类地位:RNA病毒域(Riboviria),正RNA病毒界(Orthornavirae),黄病毒门(Kitrinovirico-ta),甲型超群病毒纲(Alsuviricetes),马泰利病毒目(Martellivirales),植物杆状病毒科(Virgaviri-dae),大麦病毒属(Hordeivirus)。大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。5方法原理大麦条纹花叶病毒的血清学和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心免疫酶联吸附测定(DAS-ELISA);根据BSMV的基因组特征建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。6仪器用具与试剂6.1仪器微量天平、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱(4℃)、超低温冰箱、高压灭菌锅、pH计、超1SN/T5528—2022学兔兔标准下载净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪。6.2用具移液器(最大量度分别为1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL)、酶联板、离心管(1.5mL、0.2mL)、研磨用具(研钵研杵或小型料理机)。6.3主要试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂详见附录B。RT-PCR检测试剂详见附录C。实时荧光RT-PCR检测试剂详见附录D。7制备检测样品7.1籽粒7.1.1直接制备籽粒抽样按照SN/T2122的规定执行。根据酶联免疫测定和分子生物学检测不同的样品制备需求,随机取样或者挑选畸形、生长不成熟的籽粒直接制备检测样品。7.1.2育苗取样随机取样或挑选外观不正常的籽粒播撒在铺有无菌滤纸的培养盘中,培养过程中滤纸需一直保持湿润状态,或将挑选的籽粒浸泡萌芽后播种在无菌土中,培养观察。待长出完全舒展的叶片后,将表现有BSMV疑似症状的植株单独编号,未表现BSMV疑似症状的植株分组(10~20株为1组)并编号,根据需要分别用于酶联免疫测定和分子生物学检测。7.2种苗有症状(如叶片花叶、条斑、坏死等)的植株,每个植株进行单独编号检测。无症状植株分组并编号后进行检测,分组和检测方法参照7.1.2。7.3其他植物产品无症状或无法观察症状的其他植物产品,参照SN/T2122中规定的抽样方法进行抽样,分组编号方法和检测方法参照7.1.2。8检测鉴定8.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)将制备的样品上清液加入包被有BSMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测,每个样品至少设置1个重复。健康的植物组织作为阴性对照,感染有BSMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液作为空白对照,其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作详见附录B。2SN/T5528—2022学兔兔检测的阴性对照、阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作详见附录C。也可以使用商品化RT-PCR一步法试剂盒进行检测。8.3序列测定RT-PCR产物回收后,进行序列测定,并将测定的序列与已知的BSMV序列进行比对分析。8.4实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阴性对照、阳性对照和空白对照设置同8.2。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。9结果判定当检测出现以下结果时,则判定为BSMV检出,否则判定为BSMV未检出:———当DAS-ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR3种检测方法中有两种及两种以上的检测结果呈阳性;———当RT-PCR检测结果为阳性,且测序结果证实其同源性符合BSMV同种间同源性要求。10样品保存10.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后,未检出BSMV的样品应置于适合的条件下妥善保存3个月。检出BSMV的样品至少保存6个月,或保存至索赔有效期满,以备复核,保存期满后应经高压灭菌后方可处理。10.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的报关单号、委托单位、名称、数(重)量、产地、接收时间、检测时间、方法和结果等,并要有检测人员和审核人员签字。DAS-ELISA检测应有酶联反应的原始数据,RT-PCR检测应有电泳图片,序列测定应有所测定序列的相关文件,实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图谱。11结果复核检验结果的复核由海关总署指定单位和人员进行,主要考察实验记录、电泳照片、测定序列信息和荧光曲线图谱等资料的完整性和真实性,必要时进行复核实验。3SN/T5528—2022学兔兔(资料性)大麦条纹花叶病毒其他信息A.1寄主范围BSMV自然寄主为大麦Hordeumvulgare、小麦Triticumaestivum、燕麦Avenasativa、玉米Zeamays等禾本科植物。人工接种也可侵染甜菜Betavulgaris、藜麦Chenopodiumquinoa、藜Chenopo-diumalbum、Chenopodiumbengalense、烟草Nicotianatabacum、水稻Oryzasativa、糜子Panicummiliaceum、黑麦Secalecereale、高粱Sorghumbicolor、菠菜Spinaciaoleracea等。A.2危害症状感染该病毒后大麦和小麦出现的症状均比较复杂,因品种和外界环境等因素的不同而影响症状的出现与否、症状类型变化及发病严重度等。病株所结种子不饱满,千粒重有不同程度的降低。典型感病症状表现为叶片褪绿斑驳,深绿和浅绿相间的不规则条纹,黄色花叶或坏死斑块,整张叶片变成黄白色。大麦叶片会出现分散的褐色细小斑点,严重的则引起叶片枯死。图A.1BSMV在大麦上的危害症状(引自ThomasW.,1984)A.3分布地区主要分布国家和地区有美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚、英国、德国、法国、丹麦、波兰、前南斯拉夫、罗马尼亚、俄罗斯、埃及、土耳其、也门、巴基斯坦、日本、韩国。在中国新疆曾大面积流行过,目前在中国小麦产区局部有分布。A.4传播方式病毒主要通过种子、花粉和机械传播,种子传播能力与病毒株系、感染植物所处的生理周期以及温度有关。A.5粒体形态病毒粒体为螺旋直杆状,直径约为20nm,长度为110nm~160nm,螺旋对称,螺距为2.5nm。4SN/T5528—2022学兔兔分为3个片段α、β、γ,α大小为3.7~3.9kb,β为3.1~3.6kb,γ为2.6~3.2kb,基因组编码7个蛋白质,分别为αa、βa、βb、βc、βd、γa、γb。外壳蛋白的基因组位于RNAβ的5'端。5SN/T5528—2022学兔兔(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)B.1试剂B.1.1包被抗体特异性的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.3底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。B.1.41×PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g、氯化钾(KCl)0.2g、吐温-20(Tween-20)0.5mL。溶于900mL双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。B.1.5样品抽提缓冲液(pH7.4)亚硫酸钠(Na2SO3)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g。溶于900mL的1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。B.1.6包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na2CO3)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g。溶于900mL双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.6,定容至1000mL,4℃储存。B.1.7酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)牛血清白蛋白(BSA)2.0g、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g。溶于900mL1×PBST中,并用1×PBST定容1000mL,4℃储存。B.1.8底物缓冲液(pH9.8)二乙醇胺97mL、氯化镁(MgCl2)0.1g。溶于800mL双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4℃储存。注:以上缓冲液也可以使用商品化试剂,稀释操作步骤按使用说明进行。B.2实验步骤B.2.1包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好,37℃孵育2h。清空孔中溶液,用1×PBST加满各孔,2min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程,或使用洗板机按照上述步骤设定洗板程序,进行洗板操作。6SN/T5528—2022学兔兔∶10(W/V)加入抽提缓冲液,研磨成浆;2000g离心10min,上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按照100μL/孔加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,并设置缓冲液孔做空白对照。酶联板加盖或用保鲜膜包好,37℃孵育4h或4℃孵育过夜。酶联板倒掉缓冲液,1×PBST洗涤4次,每次2min。或者使用洗板机按照上述步骤设定洗板程序,进行洗板操作。B.2.3加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度,按照100μL/孔加入到酶联板中,酶联板加盖或用保鲜膜包好,37℃孵育4h。酶联板倒掉缓冲液,再用1×PBST洗涤4次,每次2min,或使用洗板机按照上述步骤设定洗板程序,进行洗板操作。B.2.4加底物将底物