SNT 5363-2022 鲤浮肿病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5363—2022鲤浮肿病检疫技术规范QuarantineprotocolforCarpedemavirusdisease2022-03-14发布2022-10-01实施ICS11.220CCSB41中华人民共和国海关总署发布中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编辑部：[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数21千字2022年9月第一版2022年9月第一次印刷印数1—500书号：155175·322定价：16.00元鲤浮肿病检疫技术规范行业标准SN/T5363—2022***SN/T5363—2022I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国杭州海关、河南省水产技术推广站。本文件主要起草人：温智清、贾鹏、郑晓聪、王津津、徐慧、杨雪冰、李旭东、何俊强、刘荭、史秀杰、兰文升、于力、刘莹、杨锦舜、王飞。1SN/T5363—2022鲤浮肿病检疫技术规范1范围本文件规定了鲤浮肿病的NestedPCR和实时荧光PCR检测方法。本文件适用于鲤浮肿病的流行病学调查、监测、诊断和进出境检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3术语、定义和缩略语3.1术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。CEVD：鲤浮肿病（Carpedemavirusdisease）；CEV：鲤浮肿病毒（Carpedemavirus）；PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）；Ct：循环阀值（cyclethreshold）；CTAB：十六烷基三甲基溴化胺（CetyltrimethylammoniumAmmoniumBromide）；DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）；dNTPs：脱氧核糖核苷酸（DeoxynucleotideTriphosphates）；EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide）。4设备和器械4.1普通冰箱和-80℃超低温冰箱。4.2制冰机。4.3二级生物安全柜。4.4无菌组织研磨器。4.5冷冻高速离心机。4.6PCR仪。4.7实时荧光PCR仪。2SN/T5363—20224.8水平电泳仪。4.9凝胶成像仪。4.10高压灭菌锅。4.11不同规格微量移液器，量程包括0.5mL~10mL、10mL~100mL、100mL~1000mL。4.12剪刀、镊子、酒精棉球、离心管和PCR管等耗材。5试剂5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。5.2磷酸盐缓冲液（见附录A.1）。5.3CTAB溶液（见附录A.2）。5.4抽提液1（见附录A.3）。5.5抽提液2（见附录A.4）。5.6无水乙醇，分析纯。5.7TE缓冲液（见附录A.5）。5.810×PCR扩增缓冲液（见附录A.6）。5.9Tap酶：-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5.10dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。5.11TEB电泳缓冲液（见附录A.7）。5.12溴化乙啶（见附录A.8）。5.136×上样缓冲液（见附录A.9）。5.142×实时荧光PCR预混液（见附录A.10）。5.15NestedPCR用引物，浓度为20μmol/L，序列如下：CEVForB:5’-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3’CEVRevJ2:5’-CCTCATCCAAATTACGTAGTAAAG-3’第一步PCR扩增产物为493bp大小的片段。CEVForB-int:5’-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3’CEVRevJ-int3:5’-GTTGATACAATTCCAGAGCAAG-3’第二步PCR扩增产物为426bp大小的片段。5.16实时荧光PCR用引物和探针：浓度为10μmol/L，序列如下：CEV-qf：5’-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC-3’CEV-qr：5’-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3’探针:5’-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ-3’6临床症状发病鱼游动迟缓，在水面漫游或在池塘边缘静置不动，游动时失去平衡或沉于池底侧睡，当受到惊吓等刺激时，病鱼立即游动，但很快又处于昏睡状态（其他参见附录B）。7采样采样对象包括健康的、发病的和濒死的锦鲤和鲤等鲤科鱼类，采样数量按照GB/T18088规定执行。鳃是CEV的靶器官，脑、脾、肾、心脏和肠道也可作为采样组织器官，但肝脏除外。体长≤4cm的鱼苗取整条鱼；4cm~6cm的鱼苗取所有内脏（含肾脏和鳃）；体长＞6cm的鱼取鳃(用酒精3SN/T5363—2022棉球去除鳃表面黏液)、脑、肾和脾。样品采集后，应尽快送到检疫实验室，一般不超过24h。若条件有限，发病鱼可取靶器官并浸泡至80%~100%乙醇中保存，运送至检疫实验室。8诊断方法8.1NestedPCR方法8.1.1设立对照从提取样品DNA起，均需设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取已知含有CEV的病鱼组织作为阳性对照；取健康鱼组织作为阴性对照；取等体积的无菌去离子水作为空白对照。8.1.2核酸提取（CTAB法）无菌条件下，将取得的组织在无菌研钵进行匀浆，计重后用预冷的磷酸盐缓冲液以1∶5（w/v）将组织重悬，4℃、8000r/min离心5min，取上清液待检。取450μL组织悬液加入1.5mL的离心管，加450μLCTAB溶液，充分混匀，25℃水浴作用2.5h。向离心管中加600μL抽提液1，剧烈震荡混匀30s以上，12000r/min离心5min。取上层水相（约800μL）至新的离心管，加700μL抽提液2，震荡混匀30s。12000r/min离心5min。小心取上层水相（约600μL）至新的离心管，加入1.5倍体积的预冷无水乙醇（约900μL），上下颠倒混匀后，-20℃沉淀核酸2h以上。12000r/min离心30min，弃上清液。将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥30min。向DNA沉淀中加50mLTE缓冲液，-20℃保存备用。可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法。8.1.3第一步PCR反应在反应管中加入10×PCR扩增缓冲液5μL、上下游引物（20μmol/L）各1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、Taq酶（5U/μL）1μL，DNA模板5μL，加双蒸水至总体积50μL。将反应管瞬时离心后，置于PCR仪。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，35次循环；72℃再延伸10min。第一步反应结束后可先将PCR产物进行电泳分析，若出现493bp大小目的条带，可直接进行测序分析，否则需进行第二步PCR反应。8.1.4第二步PCR反应在反应管中加入10×PCR扩增缓冲液5μL、上下游引物（20μmol/L）各1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、Taq酶（5U/μL）1μL，第一步扩增产物5μL，加双蒸水至总体积50μL。将反应管瞬时离心后，置于PCR仪。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，35次循环；72℃再延伸10min。8.1.5琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB）凝胶板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚盖过胶面。取5μLPCR产物和1μL6×上样缓冲液混匀后加入样品孔，5V/cm电泳约30min，将凝胶置于凝胶成像仪观察结果。可使用同等效果的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。4SN/T5363—20228.1.6测序对PCR扩增产物出现493bp或者426bp特异性条带进行基因序列测定，并将测序结果与参考序列（参见附录C）或Genbank中CEV基因序列进行序列同源性分析。8.1.7结果判定8.1.7.1被检样品结果的判定均建立在阳性对照、空白对照和阴性对照成立的基础之上。8.1.7.2被检样品经NestedPCR检测有493bp或者426bp特异性条带，测序结果与参考序列或Genbank中CEV基因序列相符且同源性大于等于98%，判定为NestedPCR检测结果阳性。8.1.7.3被检样品经NestedPCR检测均未扩增出目的条带或者虽有目的条带，但测序结果与参考序列或Genbank中CEV基因序列同源性低于98%，则判定NestedPCR检测结果阴性。8.2实时荧光PCR方法8.2.1设立对照同8.1.1。8.2.2核酸提取同8.1.2。8.2.3反应体系2×实时荧光PCR预混液10μL，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物（10μmol/L）0.5μL，探针（10μmol/L）0.5μL，ROXReferenceDyeII（50×）1μL，模板DNA2.5μL，双蒸水5μL，总体积20μL。可使用其他等效的荧光PCR试剂盒代替以上方法。8.2.4反应条件将反应管瞬时离心后，置于实时荧光PCR仪。条件如下：95℃10min；95℃30s，60℃45s，40次循环。8.2.5结果判断8.2.5.1被检样品结果的判定均建立在阳性对照、空白对照和阴性对照成立的基础之上。当阳性对照出现典型扩增曲线且Ct值≤35，空白对照和阴性对照无Ct值无扩增曲线，实验成立。若对照组不成立，应更换试剂盒和对照样品重新实验。8.2.5.2被检样品出现典型扩增曲线且Ct值≤35，可判定实时荧光PCR方法检测结果阳性；被检样品无Ct值无扩增曲线，可判定实时荧光PCR方法检测结果阴性。8.2.5.3被检样品35＜Ct值＜40，应增加模板浓度重新实验。重新实验后，若被检样品Ct值＞35，则判定为实时荧光PCR方法检测结果阴性；若被检样品出现典型扩增曲线且Ct值≤35，则判定为实时荧光PCR方法检测结果阳性。9综合判定实时荧光PCR方法或NestedPCR方法检测结果阳性，判定为CEVD阳性。5SN/T5363—2022附录A（规范性）试剂及配制A.1磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2）每升蒸馏水中加入氯化钠8g、氯化钾0.2g、碳酸氢钠1.15g、磷酸二氢钾0.2g，经121℃、15min高压灭菌，4℃备用。A.2CTAB溶液NaCl8.19gEDTA0.744gTri-HCl1.12g超纯水60ml充分混匀后，用盐酸调节溶液pH值至7.5~8.0，加入CTAB2g，充分搅拌溶解，用超纯水定容至终体积100mL。使用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。A.3抽提液1酚/氯仿/异戊醇，用1.0mol/LpH（7.9±0.2）Tris过饱和酚∶氯仿∶异戊醇按25∶24∶1的比例混合，密闭避光保存。A.4抽提液2氯仿/异戊醇，将氯仿和异戊醇按24∶1的比例混合，密闭避光保存。A.5TE缓冲液（pH8.0）1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）2ml加入约800mL的去离子水，均匀混合。溶液定容至1000mL。高温高压灭菌后，4℃保存。A.610×PCR扩增缓冲液KCl500mmol/LTris·Cl（pH8.3，室温）100mmol/LMgCl215mmol/L明胶0.1%A.7TBE电泳缓冲液（10