SNT 4545.4-2022 商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法四

ICS67.050CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4545.4—2022商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法四Commercialkittestmethod—Salmonella—TestmethodⅣ2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是SN/T4545《商品化试剂盒检测方法沙门氏菌》的第4部分。SN/T4545已经发布了下列部分:———商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法一;———商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法二;———商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法三;———商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法四。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人:郑晶、徐珊、肖颖、郭菁、林杰、陈练洪、柯秋璇、陈彬、柯璐、刘阳、丁旭、王玮琳、张温玲、黄嫦娇、曾维扬。ⅠSN/T4545.4—2022商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法四1范围本文件规定了食品中3M沙门氏菌测试片快速检测系统的检测方法。本文件适用于食品中沙门氏菌的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.4—2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T3266食品微生物检验方法确认技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全并防止污染,应由具备资格的工作人员进行操作。所有培养物和废弃物应按照GB19489和GB/T27405中的有关规定执行。5方法提要3M沙门氏菌测试片快速检测系统是一种预先制备好的培养基系统,含有指示剂及冷水可溶性凝胶的测试片对沙门氏菌具有选择性,含有酶底物的确认片用于沙门氏菌的生化确认。6试剂和材料6.13M沙门氏菌测试片快速检测系统(3MPetrifilmTMSalmonellaExpressSystem)参考SN/T2775和SN/T3266对3M沙门氏菌测试片快速检测系统进行了评价。具体评价结果参见附录A。3M沙门氏菌测试片快速检测系统组成如下:a)3M沙门氏菌增菌肉汤基础(SEB):按照附录B中的B.1配制;1SN/T4545.4—2022b)3M沙门氏菌增菌肉汤补充物(SESUP):按照附录B中的B.2配制;c)3M沙门氏菌测试片;d)3M沙门氏菌确认片;e)3M压板。测试片和确认片储存于2℃~8℃,有效期18个月,使用前应回温至室温。6.2磷酸盐缓冲液(PBS)按照附录B中的B.3配制。6.3无菌生理盐水按照附录B中的B.4配制。6.4Rappaort-VassiliadisR10培养基(可选)按照附录B中的B.5配制。7仪器和设备7.1冰箱:2℃~8℃。7.2均质器。7.3移液管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸头。7.4恒温培养箱:41.5℃±1℃。7.5电子天平:感量为0.001g。8检测程序3M沙门氏菌测试片快速检测系统检测程序见图1。2SN/T4545.4—2022图13M沙门氏菌测试片快速检测系统检测程序9操作步骤9.1测试片水化将3M沙门氏菌测试片放置在平坦且水平的表面,掀起上层薄膜,吸取2.0mL±0.1mL无菌稀释剂(磷酸盐缓冲液、蒸馏水或者反渗水)垂直滴加在底层凝胶的中心位置,轻轻地将上层薄膜放下,避免产生气泡,将3M压板放在测试片中心,轻轻按压使稀释剂均匀覆盖于整个测试片的培养区域内,避光静置1h使凝胶成型。水化后的测试片室温(20℃~25℃)可避光储存8h,密封于塑料袋中在-20℃~-10℃环境下可避光储存5d。9.2样品制备及增菌培养无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLSEB(已加增菌补充物,预热到41.5℃±1℃)的无菌均质袋或合适容器内,彻底混匀,于41.5℃±1℃培养18h~24h。9.3二次增菌(高背景菌须做)对高背景菌样品(水产品、未加工的牛肉/禽肉、水果、蔬菜、原料奶、宠物产品的配料)必须进行2次3SN/T4545.4—2022增菌。轻轻摇动经过初步增菌培养的样品混合物,移取0.1mL增菌液转种于10mLRV(R10)内,于41.5℃±1℃培养8h~24h。9.4测试片培养将水化后测试片置于平坦表面处放至室温,掀起上层薄膜,使用10μL无菌环(3mm直径)蘸取一满环增菌液在测试片上划线,将上层薄膜轻轻盖下,用戴手套的手轻轻扫动,除去接种区域内的所有气泡,将测试片的有色面朝上水平放置,于41.5℃±1℃培养24h±2h,叠放片数不要超过20片。9.5测试片判读观察测试片上生长的菌落,沙门氏菌典型菌落特征为红色、深红色或棕色,并带有黄色晕圈或/和气泡的菌落,其他的蓝色、蓝绿色、绿色菌落,以及不带有晕圈和气泡的红色、深红色和棕色菌均为非沙门氏菌。9.6生化确认9.6.1确认片培养挑选5个可疑菌落,并在测试片的上层薄膜上进行标记,掀起上层薄膜,插入回温至室温的确认片,使之与凝胶层贴合,将上层薄膜轻轻盖下,用戴手套的手轻轻扫动,除去接种区域内的所有气泡,确保薄膜、确认片和凝胶层接触良好,水平放置于41.5℃±1℃培养4h~5h,叠放片数不要超过20片。9.6.2确认片判读取出确认片,观察被标记的菌落的颜色变化。若标记的菌落颜色变为蓝绿色、蓝色,或者黑色,或者菌落周围带有蓝色沉淀环,则判为生化确认的沙门氏菌。从测试片凝胶层上挑取生化确认的菌落接种营养琼脂平板,按GB4789.4—2016进行多价血清鉴定。若标记的菌落颜色保留红色、深红色或棕色且不带有蓝色沉淀的,则为非沙门氏菌。10结果与报告综合以上测试片、生化确认和血清学鉴定结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。4SN/T4545.4—2022附录A(资料性)3M沙门氏菌测试片快速检测系统评价结果1)1)本评价结果仅适用于3M有限公司的3M沙门氏菌测试片快速检测系统。A.1包容性和排他性选择100株经确认的沙门氏菌标准菌株和分离菌株,用3M沙门氏菌测试片快速检测系统方法进行测试,结果全部为阳性。选择30株经确认的非沙门氏菌的标准菌株,用3M沙门氏菌测试片快速检测系统方法进行测试,结果全部为阴性。A.2灵敏度、特异性、准确度及检出限选择5个食品种类,15个食品类型的样品,采用人工污染的方式制备试验样品。分别用3M沙门氏菌测试片快速检测系统方法与参考方法GB4789.4—2016进行测试,相对准确度、相对灵敏度、相对特异性和相对检出限见表A.1。表A.1相对准确度、相对灵敏度、相对特异性和相对检出限食品基质相对准确度/%相对灵敏度/%相对特异性/%相对检出限/(CFU/g)肉类1001001000.16鱼类和海产品1001001000.16果蔬制品1001001000.24乳制品1001001000.24杂品1001001000.28A.3耐变性分别对7个实验条件进行耐变性试验:一次增菌培养温度(40℃,43℃),一次增菌培养时间(16h,26h),测试片培养温度(40℃,43℃),测试片培养时间(20h,26h,28h),确认片培养温度(40℃,43℃),确认片培养时间(2h,3h,6h),水化液(无菌去离子水,无菌RO水,磷酸盐缓冲液)。试验结果表明,当一次增菌培养时间为16h,对低浓度添加水平的样品检测结果有影响,而其他实验条件下,对检测结果无显著性影响。A.4批间变异取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间变异试验,试验结果表明,3M沙门氏菌测试片快速检测系统的批间无显著性差异。5SN/T4545.4—2022附录B(规范性)培养基和试剂B.13M沙门氏菌增菌肉汤基础(SEB)B.1.1成分SEB37g蒸馏水1000mLpH7.2±0.2B.1.2制法称取37g粉末溶解于1L去离子水,加热溶解,然后在121℃高压灭菌15min。B.23M沙门氏菌增菌肉汤补充物(SESUP)B.2.1成分SESUP50mgSEB1000mLB.2.2制法称取50mg补充物加到1L灭好菌的3M沙门氏菌增菌肉汤中。B.3磷酸盐缓冲液B.3.1成分磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g蒸馏水500mLpH7.2B.3.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。B.4无菌生理盐水B.4.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mL6SN/T4545.4—2022B.4.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。B.5Rappaort-VassiliadisR10培养基B.5.1成分RV(R10)26.6g蒸馏水1000mLpH5.1±0.2B.5.2制法称取26.6g粉末溶解于1L去离子水,加热溶解,然后在116℃高压灭菌15min。SN/T4545.4—20222202—4􀏕5454T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标准商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法四SN/T4545.4—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数20千字2022年月第一版2022年月第一次印刷印数1—500*书号:155175·801定价12.00元