DB15T 2905-2023 羊副流感病毒3型检测技术规范

ICS11.220CCSB4115内蒙古自治区地方标准DB15/T2905—2023羊副流感病毒3型检测技术规范Technicalspecificationfordiagnosticofcapineparainfluenzavirustype32023-03-10发布2023-04-10实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T2905—2023I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古科技大学包头师范学院、吉林农业科技学院。本文件主要起草人：王炜、马艳华、王镓磊、赵丽霞、杨昱萍、郭宇、韩四娥、郭利、武有志、王岩、萨如拉、高登军、王旭红、胡薇。DB15/T2905—20231羊副流感病毒3型检测技术规范1范围本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床诊断、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的诊断技术要求。本文件适用羊饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对羊副流感病毒3型的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。羊副流感病毒3型caprineParainfluenzavirustype3，CPIV3属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。4临床诊断感染羊主要临床症状表现为发热（体温≥40℃）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状。病理剖检可见肺部实变。5实验室诊断病毒分离5.1.1试剂耗材牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。5.1.2仪器电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。5.1.3病料采集DB15/T2905—202325.1.3.1鼻拭子用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3mL～5mL含1000IU/mL青霉素1000µg/mL链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.2血清使用非抗凝采血管采集新鲜血液2mL～5mL，静置分离血清，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.3肺组织疑似因CPIV3感染死亡的羊，按照NY/T541采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。5.1.4样品处理5.1.4.1拭子将鼻拭子样品液冻融两次，然后以6000r/min离心10min，再使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。5.1.4.2血清将静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。5.1.4.3肺组织取体积大小为2×2×3cm肺组织样品，按照体积比为1:3～1:5的比例加入含有双抗的PBS（pH7.2～7.4），研磨成匀浆液，冻融两次，再以6000r/min离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃下保存备用。5.1.5细胞接种取处理过的样品接种到长满80%的24孔板MDBK细胞，每孔200μL，置于37℃，含5%CO2的培养箱中吸附30min后，加入含2%FBS或NBS的细胞培养液1mL，同时设对照组，置于37℃，5%CO2培养箱，培养3d～5d，逐日观察，记录细胞病变。按上述方法盲传3～5代。5.1.6结果判定逐日观察细胞病变，表现为细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状（见附录A.2）；当70%～80%细胞出现病变时收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，取上清进行5.2的检测。RT-PCR5.2.1试剂耗材移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒（阳性对照）、灭菌超纯水（阴性对照）、引物。5.2.2仪器PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。DB15/T2905—202335.2.3待检样品处理后的样品或细胞培养物。5.2.4病毒RNA提取使用病毒RNA提取试剂盒提取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品RNA，并使用核酸分析仪对RNA质量及浓度进行测定。5.2.5RT-PCR反应体系5.2.5.1RT反应引物CPIV3-F/CPIV3-R按照附录A.3进行引物序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/L。20μL体系：下游引物1μL，dNTPMixture1μL，模板RNA2μL，RNaseFreedH2O6μL。65℃保温5min后，转至冰上迅速冷却。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μL，RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL(20U)，PrimeScriptIIRTase(200U/μL)1μL，RNaseFreedH2O4.5μL，缓慢混匀。反应条件为42℃45min，95℃5min，然后冰上冷却。5.2.5.2PCR反应5.2.5.2.1反应体系Premix溶液12.5µL，上下游引物各0.5µL，cDNA模板2µL，RNaseFreedH2O9.5µL。5.2.5.2.2反应条件95℃预变性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，进行35个循环，72℃延伸10min。5.2.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳和成像取PCR产物10µL，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。5.2.7结果判定当阳性对照样品出现400bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为羊副流感病毒阳性，否则为阴性（见附录A中图A.2）。间接ELISA抗体检测5.3.1试剂耗材CPIV3重组N蛋白、阴性血清、阳性血清、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗、酶标板、TMB底物显色试剂盒，抗原包被缓冲液、洗涤液、封闭液、终止液按照附录B配制，用水标准应符合GB/T6682要求。5.3.2仪器水浴锅、温箱、洗板机、微量振荡器、酶标仪、移液器。5.3.3操作方法5.3.3.1抗原包被DB15/T2905—20234将CPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃包被16h。5.3.3.2洗板甩掉孔内的包被液，以洗涤液洗涤三次，用量为200µL/孔。5.3.3.3封闭每孔加封闭液，用量为200µL/孔，置37℃封闭1h,洗涤三次。5.3.3.4加样阴、阳性血清和被检血清均用封闭液作200倍稀释，每个样品两个平行，每孔100μL，每块板均设阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放于37℃孵育1h，洗涤三次。5.3.3.5加酶标记抗体每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100µL，置37℃再孵育1h，洗涤三次。5.3.3.6加底物溶液加入显色底物（TMB）溶液100µL/孔，置37℃避光反应15min。5.3.3.7终止反应加入终止液50µL/孔,混匀后即刻测量OD450值。5.3.4结果判定P/N比法：被检样品(P)的吸光度值和阴性对照样品(N)值之比。P/N≤1.50判为阴性2.0＞P/N＞1.50判为可疑P/N≥2.0判为阳性6综合判定经4判定为疑似CPIV3感染病例，经5.1或5.2其中一种方法检测出CPIV3，判为羊副流感病毒3型感染。临床无明显特异症状的非免疫动物经5.3检测出CPIV3，判为羊副流感病毒3型感染。DB15/T2905—20235AA附录A（资料性）病毒分离鉴定A.1羊副流感病毒3型简介羊副流感病毒3型（Caprineparainfluenzavirustype3，CPIV3）属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。数据表明，我国CPIV3在山羊和绵羊群流行率较高，可通过粪便-口腔或空气传播。羊副流感病毒3型可引起羊发热（体温大于等于40℃）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状，如继发细菌或支原体感染可引起病情加重，导致呼吸道疾病综合征，造成宿主的死亡。自然感染与人工感染均可对山羊和绵羊产生致病性。病理剖检可见肺部实变。A.2CPIV3病变示意图CPIV3病变示意图见图A.1。注：图A：正常MDBK细胞对照图；图B：CPIV3感染MDBK细胞病变图。图A.1CPIV3病变示意图A.3PCR引物A.3.1引物信息PCR引物序列见表A.1表A.1PCR引物序列引物序列(5’-3’)位置目的片段参考毒株CPIV3-FCATTGAATTCATACTCAGCAC1-400400bpAF035681.1CPIV3-RAGATTGTCGCATTTRCCTCA.3.2引物溶解上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/L。A.3.3羊副流感病毒3型非结构蛋白C基因PCR产物核苷酸序列CATTGAATTCATACTCAGCACAGATACCCAAGAAAGTCCAATCAACGATGACGGAATCACAGCCGGAGAAACAAAACTTAGCTCAACAATCTTCCAAACAGAGTCCCAAGCAGCCAAAATATACAGGGAAAATAGTGGATCAATTGACCAAGATAGATGGGCTAGGCCATCATACAAATATACCACAAAAACAGAAAATAGAGATGTTGATCAAGAGGTTATACAGAGAGGAGATAGGCGAAGAAGCAGCGCAAGTGGTGGAADB15/T2905—20236CTAAGATTATGGGCGATGGAAGGGTCTCCAGAAGCAGCACGGATCCTAGCCATGGATCCCAAGTCCAGGAGGGTACTGATAACAATGAAATTGGAGAGATGGATACGAACTCTCCTCAGAGGTAAATGCGACAATCTA.4电泳结果电泳结果见图A.2。注：M：DL2000；1：阴性对照；2：阳性对照。图A.2PCR电泳图DB15/T2905—20237BB附录B（规范性）试剂的配制B.1抗原包被缓冲液（0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠0.318g碳酸氢钠0.588g去离子水200mL用0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。B.2洗涤液—PBSTpH7.4PBS1000mL吐温-200.5mL现配现用。B.3封闭液（含2%BSA的PBST）pH7.4PBS1000mL吐温-200.5mLBSA20g现配现用。B.4终止液111mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889mL去离子水中，分装保存备用。