DB3301T 1120-2023 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR标记法

ICS65.020.01CCSB053301浙江省杭州市地方标准DB3301/T1120—2023三叶青种质资源鉴定技术规程SSR标记法2023-02-28发布2023-03-28实施杭州市市场监督管理局发布学兔兔—2023I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14原理...............................................................................15仪器设备及试剂.....................................................................16溶液配制...........................................................................37操作程序...........................................................................38判定方法...........................................................................4附录A（规范性）溶液配制.............................................................6附录B（资料性）推荐引物.............................................................8学兔兔—2023II前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由杭州市农业农村局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：杭州市农业科学研究院、杭州市农业农村事务保障中心。本文件主要起草人：严建立、黄雨晴、阮松林、钱丽华、应武、陆秋君、蔡和平。学兔兔—20231三叶青种质资源鉴定技术规程SSR标记法1范围本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats,SSR）标记进行三叶青（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg）不同种质资源鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序及判定方法。本文件适用于三叶青种质资源SSR指纹数据采集及种质资源鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。引物primer在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的一小段单链脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA）或核糖核酸（RibonucleicAcid，RNA）。参照种质资源referencegermplasmresource具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照种质资源用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。注：本文件选用的参照品种为：三叶青2012-1。4原理由于不同三叶青种质资源遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列（SSR）的重复次数有差异，从而使得不同种质资源中的简单重复序列长度存在差异。这种差异可以通过聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同种质资源。5仪器设备及试剂一般规定学兔兔—20232本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682—2008中规定的三级水。仪器设备本方法中所用的仪器设备包括：a)普通电泳仪；b)垂直电泳槽及配套的制胶附件；c)水浴锅；d)水平摇床；e)高速冷冻离心机（最大离心力不小于20000g）；f)电子天平（精度为千分之一）；g)微量移液器（量程分别为10µL、20µL、100µL、200µL、1000µL、5000µL）；h)pH计；i)冰箱（4℃和-20℃）；j)磁力搅拌器；k)核酸定量测定仪；l)微波炉；m)高压蒸汽灭菌锅；n)制冰机；o)组织破碎仪；p)凝胶成像系统；q)超纯水仪。所用试剂本方法中所用的试剂包括：a)十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB）；b)三氯甲烷；c)异戊醇；d)异丙醇；e)乙醇；f)乙二胺四乙酸二钠；g)三羟甲基氨基甲烷；h)SSR引物；i)DNA标准分子量标记（marker）；j)5×PCR预混液Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂）；k)琼脂糖；l)冰醋酸；m)氢氧化钠；n)丙烯酰胺；o)甲叉双丙烯酰胺；p)过硫酸铵；q)四甲基乙二胺；r)硝酸银；学兔兔—20233s)甲醛；t)乙二胺四乙酸；u)硼酸；v)氯化钠。6溶液配制按照附录A的规定配制溶液。7操作程序样品准备选取三叶青幼嫩叶片，每份样品检测5张叶片的混合样，并设置三个重复。DNA提取DNA提取应按照以下步骤进行：a)将0.5g叶片剪碎后放入2.0mL离心管，加入800µL经65℃预热的十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide,CTAB）缓冲提取液，加入2粒钢珠，置于组织破碎仪上研磨充分成匀浆；b)上述匀浆经65℃水浴1h，期间颠倒混匀2次～3次，取出静置2min，而后在离心机中10000g离心15min，用移液器小心吸取500µL左右上清液至另一个洁净离心管中，加入500µL的三氯甲烷:异戊醇（体积比为24:1）溶液，颠倒混匀，置于离心机中10000g离心10min；c)小心吸取上述所得上清液约450µL，加入异丙醇300µL，颠倒混匀，在-20℃冰箱中放置20min，置于离心机中10000g离心15min；d)倒掉上述上清液，依次加500µL75%和100%乙醇各洗一次，晾干后，加入100µL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTAbuffersolution，TE）水溶液溶解，经核酸定量测定仪测定DNA浓度，用超纯水将DNA稀释至约100ng/µL，以备后续PCR扩增，-20℃保存。PCR扩增7.3.1引物选择宜选择附录B中引物进行扩增。7.3.2反应体系SSR-PCR扩增体系为15µL，包括3µLPre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂）、1µL模板（含75ng～100ng上述提取所得DNA）、0.6µL正向引物（0.4μmol/L）、0.6µL反向引物（0.4μmol/L）和超纯水9.8µL。7.3.3PCR反应程序PCR反应程序如下：a)94℃预变性5min；b)94℃变性1min；学兔兔—20234c)60℃退火45s；d)72℃延伸30s～60s；e)重复b）～d），共35个循环；f)72℃延伸5min；g)4℃保存。PCR产物检测7.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳7.4.1.1凝胶准备凝胶制备应按照如下步骤进行：a)将垂直夹心式电泳装置的玻璃板与胶皮套装在一起，取微波炉煮沸后的1%琼脂糖封胶液约5mL封住玻璃板底部的缝隙，制成铸胶槽；b)在烧杯中依次加入5mL5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液，5mL40%丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液，超纯水14.8mL，摇匀后加入200µL10%过硫酸铵和12µL四甲基二乙胺（TEMED），搅拌混匀后注满铸胶槽，随即插好样孔梳，于室温下静置直至凝胶完全聚合后使用。7.4.1.2电泳去掉封口的琼脂糖胶，将胶板固定于垂直电泳槽中，在电泳槽中加满1×TBE缓冲液，小心抽出样孔梳，用移液器吸取TBE缓冲液冲洗每个点样孔2次，然后向加样孔中点入1.5µLPCR反应产物；同时，在一侧加样孔中加入DNA标准分子量标记（marker）。按样品向正极迁移接通电源，以5V/cm（正负极间距离）恒压电泳约2.5h。7.4.2银染显色电泳完毕后关闭电源，取下玻璃板。小心分开两块玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶30s～60s，放入染色液中，轻摇5min～10min进行染色；然后将凝胶从染色液中取出，用蒸馏水快速漂洗2次，每次30s～60s，放入显影液中，轻摇至显色出清晰带纹，取出凝胶用蒸馏水冲洗2遍，沥干后扫描或拍摄成像。数据处理应根据扩增产物的电泳图谱，在相同迁移位置处，有电泳条带记为“1”，无条带记为“0”，生成矩阵。以此来实现电泳带型的数据化，并鉴定参试材料。示例：标记SSR-X在所有材料中共扩增出4条大小不同的条带，按照从小到大依次编号为SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-X-3、SSR-X-4，用标记SSR-Y分析在所有材料中共扩增出3条大小不同的条带，依次编为SSR-Y-1、SSR-Y-2、SSR-Y-3。若材料1显示的条带为SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-Y-1、SSR-Y-3，则其带型数据为1100101，若材料2显示的条带为SSR-X-1、SSR-X-3、SSR-Y-1、SSR-Y-3，则其带型数据为1010101，同样可给出其它参试材料的带型数据。由此，可建立每份材料的数字化指纹，每一数字对应一个扩增条带或位点。8判定方法按照由带型数据赋予的数字化指纹，可单独或联合使用的标记鉴定材料材料的异同，具体如下：a)当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”；b)当样品间差异位点数=1，判定为“高度相似”；学兔兔—20235c)当样品间差异位点数=0，判定为极近似或相同。学兔兔—20236AA附录A（规范性）溶液配制A.1DNA提取溶液的配制A.1.1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）20.0g、氯化钠（NaCl）81.816g、乙二胺四乙酸（EDTA）2.922g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.114g于1000mL烧杯中，加入800mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。A.1.2TE水溶液称取乙二胺四乙酸（EDTA）0.292g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.211g于1000mL烧杯中，加入800mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。A.1.3三氯甲烷-异戊醇（24:1）按体积比24:1的比例配制混合液