BJS 201907 鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测

—1——鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS2019071范围本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼（Anoplopomafimbria）、油鱼（Lepidocybiumflavobrunneum，Ruvettuspretiosus）和南极犬牙鱼（Dissostichuseleginoides，Dissostichusmawsoni）源性成分的实时荧光PCR检测方法。本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品（不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。2原理使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。3试剂和材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1引物探针序列3.1.1裸盖鱼源性成分NADH2基因裸盖鱼源成分5’端引物：5’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3’裸盖鱼源性成分3’端引物：5’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3’裸盖鱼源性成分探针：5’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3’3.1.2油鱼源性成分Cytb基因油鱼源性成分5’端引物：5’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3’油鱼源性成分3’端引物：5’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3’油鱼源性成分探针：5’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3’3.1.3南极犬牙鱼源性成分CK基因南极犬牙鱼源性成分5’端引物：5’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3’南极犬牙鱼源性成分3’端引物：5’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3’南极犬牙鱼源性成分探针：5’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3’3.1.4内参照基因真核生物18SrRNA—2——内参照5’端引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’内参照3’端引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3’3.2商业化DNA提取试剂盒。3.3商业化PCR反应预混液。4仪器和设备4.1实时荧光PCR仪。4.2微量紫外分光光度计。4.3恒温水浴锅。4.4高速冷冻离心机：离心力18,000g以上。4.5微量移液器（0.5μL-10μL，10μL-100μL，20μL-200μL，100μL-1000μL）。4.6涡旋振荡器。4.7天平：感量0.001g。5分析步骤5.1样品前处理（1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。（2）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。（3）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。5.2DNA提取按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。5.3DNA浓度测定取1μLDNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。5.4实时荧光PCR扩增实时荧光PCR反应体系见表1。表1实时荧光PCR反应体系PCR预混液（2×）10μL10μmol/L上游引物0.4μL—3——10μmol/L下游引物0.4μL10μmol/L探针0.2μLDNA20-50ng灭菌去离子水补充至总体积20μLPCR反应程序：95℃15s；95℃5s，60℃34s（读取荧光），40个循环。5.5实验对照分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。阳性对照：含相应物种的DNA。阴性对照：不含相应物种的DNA。PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取。6结果判断与表述6.1质量控制若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；阴性对照：Ct值≥35.0；PCR空白对照：Ct值≥35.0；空白提取对照：Ct值≥35.0；内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；样品平行反应：Ct值经6.2结果判定后应一致。6.2结果判定（1）如Ct值＜30.0，且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。（2）如Ct值≥30.0，且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。6.3结果表述检出XXX源性成分。未检出XXX源性成分。7防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。8方法检出限裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1%~5%，油鱼引物探针检出限范围为1%~10%，南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1%~2%。—4——注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。本方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院。验证单位：河南省产品质量监督检验院、天津市食品安全检测技术研究院、重庆市食品药品检验检测研究院、福建省食品药品质量检验研究院、广东省食品检验所。主要起草人：林霖、张世伟、吴佳辉、王坤、杨国武、杨俊。