流式细胞凋亡分析

流式细胞凋亡分析概念细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。概念细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。概念细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。概念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：清除无功能的细胞；控制细胞数量；清除病态的或有害的细胞；清除多余的细胞；细胞凋亡的特征形态学特征：光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA发生裂解所致。细胞凋亡的特征形态学特征：DNA降解后，形成长度主要为180-200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptoticbodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。细胞凋亡的特征形态学特征：电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。细胞凋亡的特征形态学特征：细胞凋亡的特征形态学特征：细胞凋亡的特征形态学特征：共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。细胞凋亡的特征形态学特征：凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发生凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为caspase。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：caspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的caspase进一步激活其他的caspase前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：目前已发现15个caspase家族成员，分别命名为caspase-1～15，并根据其功能特点分成两类，即启动caspase(caspase-2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、6、7）。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：启动caspase作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位点的进程。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。细胞凋亡的特征生化特征：2核酸内切酶的激活：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接DNA降解，形成长度主要为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA片断大小不一，无“梯状”条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。细胞凋亡的特征生化特征：2核酸内切酶的激活：细胞凋亡的特征生化特征：3线粒体的变化：线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。细胞凋亡的特征生化特征：3线粒体的变化：线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：4胞质Ca2+和pH的变化：细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流促使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。细胞凋亡的特征生化特征：4胞质Ca2+和pH的变化：此外，Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：4胞质Ca2+和pH的变化：细胞pH的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质pH降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质pH降低可能与胞质Ca2+升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性DNaseⅡ启动细胞凋亡。pH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类：1诱导基因：野生型p53基因、c-myc、细胞表面抗原基因Apo-1(Fas)等2抑制基因：bcl-2、突变型p53基因和ras基因等细胞凋亡的基因调控上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或推迟凋亡。细胞凋亡的基因调控诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDS、霍奇金淋巴瘤等。细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：1bcl-2是研究最早的与凋亡有关的基因。bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、p53、c-myc及生长因子等激发的凋亡。细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：2p53p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。P53在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或gamma射线照射后，含正常p53的细胞，可发生凋亡，而p53基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型p53对凋亡起促进作用，突变型p53对凋亡起抑制作用。细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：3Fas和Fas配体Fas是肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。Fas配体（Fasligand,FasL)是TNF家族的细胞表面分子。FasL与其受体Fas结合导致携带Fas的细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞和可溶性的FasL与Fas交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2过度表达能抑制Fas致凋亡作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡的基因主要有bcl-2基因家族、p53基因、Fas基因家族和c-myc基因家族。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组织类型有关。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（SLE）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有Fas和bcl-2等。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态学和生化特征。plaque基底细胞层bcl-2阳性细胞数显著下降。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性T、B淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海马CAI区的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：这种凋亡发生在缺血后1-2天，并在缺血周边区域出现bcl-2蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生bcl-2，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到Fas抗原mRNA明显增加，提示Fas在凋亡中起一定作用。细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。细胞凋亡与疾病感染性疾病：HIV感染可导致AIDS