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DBI®BioscienceDBIResearchProductsTel:400-711-6961www.xinghanbio.comHotstarTaqDNAPolymerase浓度：2.5U/µl产品规格DBI-2057DBI-2058HotstarTaqDNAPolymerase250U1000U10×HotstarTaqBuffer0.5ml2ml25mMMgCl20.5ml2ml2mMdNTP0.5ml2ml●储存条件HotstarTaqDNAPolymerase-20°C长期保存。10×HotstarTaqBuffer-20°C长期保存；如果长期储存于4°C会析出沉淀，使用前混合均匀，不影响使用效果。●产品简介ØHotstarTaqDNAPolymerase是经过化学修饰基团修饰的热启动酶，适用于HotStartPCR。高温加热前，化学修饰基团与Taq酶结合，抑制聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。使用HotstarTaqDNAPolymerase扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，可直接克隆于T-Vector中。●单位定义74°C，30min，使10nmoldNTP掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。活性检测条件：50mMTris-HCl(pH9.0，25),50mMNaCl,5mMMgCl℃2,0.2mMeachdNTPs(包括[3H]-dTTP),200µg/ml活化的小牛胸腺DNA和0.1mg/mlBSA。●酶储存缓冲液100mMKCl,10mMTris-HCl(pH8.0),0.1mMEDTA,1mMDTT,0.5%Tween20,0.5%NP-40,0.4%BSA和50%(v/v)甘油。●10×HotstarTaqBuffer优化的PCRBuffer使PCR具有更高的灵敏度和特异性，10×HotstarTaqBuffer含KCl，(NH4)2SO4，Tris-HCl，pH8.3(25°C)，和特殊HotstarPCR增强剂。●质量控制SDS-PAGE检测纯度大于99%；经检测无外源核酸酶活性，PCR方法检测无宿主DNA残留，能有效扩增人类基因组中的单拷贝基因。●PCR体系成分△模板DNA的纯度1.很多残留的核酸提取试剂会影响PCR反应，包括蛋白酶、蛋白变性剂(比如SDS、胍盐)、高浓度盐(KAc、NaAc、辛酸钠等)和高浓度EDTA等。这些杂质可通过乙醇或异丙醇沉淀后用66-70%乙醇洗涤两次去除，大部分商品化的核酸纯化试剂盒可有效去除这些杂质。2.cDNA作为模板时，应考虑模板中高浓度盐离子(尤其是Mg2+)；PCR产物作为模板还需考虑DNA含量(参考△模板DNA用量)。3.高纯度、高浓度的DNA作为PCR模板是最理想的。高浓度DNA可通过稀释减少干扰PCR的成分。△模板DNA用量极微量的样品可以作为PCR摸板，但为了保证反应的灵敏性，25µl体系使用104拷贝的靶序列作为模板；可参考表2计算需加入PCR体系的模板量。表2：1µg各种来源的DNA对应的摩尔数1µgDNAmol1kb线性双链DNA9.18×10113kb质粒DNA2.9×1010Lambda(λ)DNA1.9×1010E.coli基因组DNA2.0×108人类基因组DNA3.0×105例如：纯化的人类基因组DNA浓度为1µg/µl，某基因在人类基因组中拷贝数为10，其单位体积拷贝数为：3.0×105mol/µg×1µg/µl×10copy/mol=3.0×106copy/µl1×104copy/(3.0×106copy/µl)=1/300µl即：1/300µl浓度为1µg/µl的人类基因组DNA中含104拷贝该基因，稀释300倍后加1µl至25µlPCR体系。为保证反应的特异性，DNA终浓度应小于10ng/µl，过多的DNA可能会出现涂抹带甚至无特异性条带。一些特定的模板可参考表3决定模板量。表3：25µlPCR体系特定模板用量特定模板25µlPCR体系用量cDNA<2.5µl(<10%PCR体系体积)PCR产物用TE＃稀释100~1000倍后，1µl菌液用TE＃稀释100~1000倍后，1µl菌落分散于0.1~1mlTE＃，1µl＃TE:10mMTris,pH8.0(25°C),1mMEDTA。TE有利于DNA储存，溶于TE的模板用量不可超过PCR体系的体积的10%，因为EDTA会螯合Mg2+而抑制酶活性。如果稀释后的模板只需短时间储存，建议用去离子水稀释。△引物浓度PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建www.fineprint.cnDBI®BioscienceDBIResearchProductsTel:400-711-6961www.xinghanbio.com一般每条引物配制的浓度为10µM(50×)，工作浓度为0.2µM。引物过量可能会出现非特异性扩增，引物过少可能会降低扩增效率。△dNTPsdNTPs应少量分装，减少反复冻融避免降解。常规PCR中dNTPs使用终浓度为0.2mM(each)，浓度过低会降低PCR产物的产量；浓度过高会因dNTPs上的磷酸根螯合Mg2+降低游离Mg2+浓度而抑制PCR。●PCR参数设置△预变性◆重要提示：本产品使用经过化学修饰型HotstartTaqDNAPolymerase，与其他公司的抗体型HotStart用DNA聚合酶相比，90℃以下避免了副反应的产生，需要PCR反应前的955℃分钟酶的活性化反应。如果高温处理时间太短，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，推荐设定为955℃分钟。△退火1.退火温度是PCR的关键，温度过高可能降低产量，温度过低可能产生引物二聚体或非特异性扩增。2.初次使用一对引物时可尝试低于Tm5°C(如果两条引物Tm不同，参考较低的Tm)作为退火温度。一般引物合成公司会提供所合成引物的Tm，也可以根据此公式估算引物Tm：Tm=2°Cx(A+T)+4°Cx(G+C)。3.最佳退火温度需要进行梯度PCR确定；或者使用递减PCR(TouchDownPCR)的方法提高特异性。△延伸延伸温度通常为72°C，延伸时间长短取决于目的DNA片段长度，以1kb/min计算所需延伸时间，时间过长可能会导致非特异性增加。循环结束后，继续延伸5~10min，以获得完整的双链产物。△循环数一般使用25~35个循环，低拷贝模板可适当增加循环数。过多的循环数不见得可以提高PCR产量，相反可能会增加非特异性扩增，减少特异性产物。●使用方法1.PCR成份准备将10×HotstarTaqBuffer，25mMMgCl2，dNTPs,模板DNA和引物室温解冻后置于冰上。2.PCR反应液配制(以50µlPCR体系为例)在冰上将以下各成分加入PCR反应管：模板DNA＊Primer1(10µM)1µlPrimer2(10µM)1µldNTPs(2mMeach)5µl10×HotstarTaqBuffer5µl25mMMgCl24ulHotstarTaqDNAPolymerase1µldiH2O补充至50µl＊请参考●PCR体系成分△模板DNA用量。注意：尽可能使用合适精确度的加样器，并且避免加样体积小于1µl(可按适当比例稀释后加样)。3.手指轻弹PCR反应管充分混匀，简短离心。4.PCR反应循环设置举例95°C5min95°C30sec55°C30sec30cycles※72°C1min§72°C5min4°Csoak※以实际最佳退火温度为准。§以1kb/min计算。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建www.fineprint.cn