OD值与吸光度值

OD值1.朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：A＝－lgT＝εbcA——吸光度，又称光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol－1·cm－1）。b——样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm。C——样品浓度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。2.DNA和RNA的OD值2.1原理嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），在230nm处为吸收低谷，其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知，c＝A/εb，而b通常为1cm，所以，通常以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。2.2纯度DNA和RNA的纯度可以通过测定260nm，230nm和280nm的紫外吸收值来测定，纯的DNAOD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，纯的RNAOD260／280在1.9-2.0，如果DNA比值高于1.8-1.9，可能有RNA没有去除干净，如果DNA比值小于1.8-1.9，可能含有酚或者蛋白质（RNA中含有酚或者蛋白质比值也会降低），若OD260／230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。2.3浓度DNA和RNA的量，据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知测量样品的浓度为c＝A/εb，又知ε＝0.020，在b＝1cm的情况下，c＝A/（0.020×1）＝50×A，则未稀释的样品的浓度为50×A×稀释倍数（μg／mL）＝50×A×稀释倍数/1000（mg／mL）2.4注意事项：1)比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。2)检测时应使OD260值在0.15到1.0之间，数值比较准确。3)这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul／ml的时候，浓度小于0.25ul／ml的时候测量误差较大。4)既含有RNA又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA，或者测定一下是不是含有蛋白质；5)A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10mMTrisCl,pH8.5中检测，此时纯净的DNAA260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。6)进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。7)可以在220-330nm之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260，如在325nm处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)8)DNA的量与260nm处的吸光度值（OD值）成正比，在引物设计时，1个OD值的合成DNA的重量约为33mg。