EnzymeThermistor的乳品安全快速分析技术

SCANDINAVIANEXCELLENCEFROMLUNDUNIVERSITY2LUNDUNIVERSITY谢斌瑞典Lund大学纯与应用生物化学系武汉2013.03EnzymeThermistor-酶热生物传感技术及其乳品安全的快速分析3LUNDUNIVERSITY什么是生物传感器?分子识别信号传感电信号生物传感器原理4LUNDUNIVERSITY生物量热–一种万能的生物分析平台•生物反应中的热量变化是一种常见形式•酶-底物催化的特异性•生物反应产生足够的热量•测量系统对光、浊度、电等不敏感•采用差分量热，环境温度变化影响小•极高的分析精度（10-5℃)•适合于有机相•热敏传感器无需校正•样品（如，血液、奶等）一无需预处理，可直接进样分析•采用流动注射分析，检测快速、成本低（约1元人民币/样品）•可连续、在线分析5LUNDUNIVERSITY早期设计样品酶Peltier器件酶热敏电阻样品酶流动管热敏电阻热酶电阻(a)静态分析(b)静态或流动分析(c)流动分析6LUNDUNIVERSITY酶热生物分析系统Experimentalset-upofanenzymeflowmicrocalorimetricdevice.7LUNDUNIVERSITY酶热生物分析仪8LUNDUNIVERSITY生物固相9LUNDUNIVERSITY酶热生物传感原理ΔT=ΔH·nρCγTrTmSCΔT=Tm-TrCγ:反应器热容量ΔH:反应中热焓的变化nρ:反应物摩尔数S:底物P:产物P10LUNDUNIVERSITY酶催化热焓变化●多数酶催化反应为放热反应,ΔH0-ΔH=-100kJ/mol为典型的过氧化物酶和氧化酶的热焓，其它酶在同一数量级-氧化酶可与过氧化物酶共同固相-ΔH变化叠加，增加热信号-消除过氧化氢危害，稳定了酶活性-产生额外的50%氧●Tris缓冲液能加大质子热焓，从而对如，蛋白酶等增加约-47kJ/mol的热量11LUNDUNIVERSITY传感装置参数流速:0.5-2ml/mL样品量:0.01-1mL测量时间:1-6min酶柱容量:0.2-1mL固相酶量:50units/柱固相材料:CPG,传感器:热敏电阻12LUNDUNIVERSITY传感器酶柱进样样品环：50-500µL酶柱内径（I.D）:1-2mm酶柱容量：0.5to1mL13LUNDUNIVERSITY固定化酶方法（戊二醛共价交联）可控多孔(120-160nm)玻璃珠(CPG):琼脂糖凝胶:CL-6B网状玻化碳（RVC）溶胶凝胶固定化细胞方法钙果胶凝胶海藻酸钙凝胶细胞嵌入琼脂糖颗粒14LUNDUNIVERSITY酶热生物传感电极15LUNDUNIVERSITY酶柱装载16LUNDUNIVERSITY电极置位17LUNDUNIVERSITY检测条件设置18LUNDUNIVERSITY检测响应信号19LUNDUNIVERSITY性能特点•是一种万能的生物分析平台。原理上只要存在相应的酶，•就能对其底物进行特异的检测••传感器与流动样品隔离，不受光，电和化合物的直接干扰，•无需经常校正••无需对待测样品，如全血、发酵液、奶等进行预处理，•可直接进样分析••可进行现场的连续、在线分析，如发酵过程检测和血糖动态监测••可实现多分析物的同步检测和分析••酶柱可反复使用数百次，检测成本低，并易于更换••测量快速（约1-5分钟/样品），操作简便，可实现自动检测分析••已实现商品化和系列产品，并能根据用户的特殊要求打造••除酶分析外，还可用于细胞、微生物、酵母、ATP等分析•20LUNDUNIVERSITY应用领域●临床分析，如糖尿病●发酵过程监测，如青霉素发酵●食品安全检测分析，如乳品中非法添加剂青霉素、β-内酰胺酶等●环境污染分析，如持续有机污染物氯酚、重金属、农药残留物等●生物分析中，如酶分析、免疫分析、细胞分析、微生物分析、DNA分析等●远程健康监测21LUNDUNIVERSITY已检测的分析物实例AnalyteEnzyme(s)usedLinearrange(mM)________________________________________________________________________AscorbicacidAscorbateoxidase0.01-0.6ATP(orADP)Pyruvatekinase+hexokinase10nM-*Cellobioseß-Glucosidase+0.05-5glucoseoxidase/catalaseCephalosporinsCephalosporinase(ß-lactamase)0.005-10CreatinineCreatinineiminohydrolase0.01-10EthanolAlcoholoxidase0.0005-1GlucoseHexokinase0.5-25GlucoseGlucoseoxidase/catalase0.0002-1(75**)L-LactateLactate-2-mono-oxygenase0.002-2L-LactateLactateoxidase/catalase0.001-122LUNDUNIVERSITYAnalyteEnzyme(s)usedLinearrange(mM)________________________________________________________________________L-LactateLactateoxidase/catalase10nM-*(orpyruvate)+lactatedehydrogenaseOxalateOxalateoxidase0.005-0.5Penicillinß-Lactamase0.005-200SucroseInvertase0.05-100UreaUrease0.005-200________________________________________________________________________23LUNDUNIVERSITY乳品安全快速检测分析24LUNDUNIVERSITY牛奶非法添加剂•Illegaladditionofβ-lactamasewasdiscoveredinChina,in2007.Accordingtothereport,β-lactamaseactivitywasfoundin49outof77individuallypackedmilksamplescollectedfrom5retailstoresin3cities.Someofthesesampleshadextremelyhighβ-lactamaseactivity.•TheministryofhealthofthePeople’sRepublicofChinaincludedβ-lactamaseintoitsnewlypublished“blacklist”ofillegalfoodadditives.25LUNDUNIVERSITYβ-内酰胺酶检测MethodsHPLCCylinderplatemethodchromogenicmethodDisadvantagesSamplepreparationTimeconsuming:24hr/testTimeconsuming:30min-24hr/testModifiedcylinderplatemethod:beta-lactamaseactivityisdefinedasadifferencebetweentheinhibitoryzonesofthetestsamplesandcontrolsamples.Chromogenicmethod:hydrolyticactivityofbacterialfl-lactamaseswasestimatedbythemeasurementofabsorbancechangesofnitrocefinandpiridinium-2-azo-p-dimethylamilinechromophase(PADAC).26LUNDUNIVERSITY乳品快速检测装置β-内酰胺酶响应待测奶样品27LUNDUNIVERSITY乳品中β-内酰胺酶检测β-内酰胺酶检测分析是基于这一原理:即，将特异性的酶催化反应与精确的流动量热分析结合起来，从而实现独一无二的、快速的乳品分析。其检测原理如下图所示。28LUNDUNIVERSITY测量方法和结果1.Calibration29LUNDUNIVERSITY1.Effectofflow-rate2.Effectofsamplevolume3.Effectofmilkcontents30LUNDUNIVERSITY牛奶中β-内酰胺酶的检测响应0.25U/ml0.5U/ml1.0U/ml2.0u/ml5.0U/mlControly=0.6458xR²=0.992900.511.522.533.50246ΔT(m℃)penicillinaseactivity(IU/ml)01020304050607080Time（min）Penicillinaseactivitydeterminedinmilkwith3%fatand50%(v/v)dilution.1mMpenicillinG,flowrateof0.5ml/minandthesamplevolumeof350μlwereapplied.31LUNDUNIVERSITY不同方法优缺点对比costpersampleTime(min/sample)ContinuityDetectionlimitModifiedETmethod≈0.1$6minSemi0.5u/mlCylinderplatemethod[5]n/a24hrNo4u/mlChromogenicmethod[7]n/a30min~24hrn/a0.49u/ml32LUNDUNIVERSITYET特点分析方法简单、仪器操作方便待测奶样品无需特殊预处理测量快速（约5-7分钟/每样品）检测成本低（约1元人民币/每样品）灵敏度高（β-内酰胺酶的检测低于0.5U酶活性/ml奶样品）适合原料奶、奶制品和其他液态食品中的β-内酰胺酶的检测可用于其它酶的检测或酶底物的分析33LUNDUNIVERSITY乳腺炎奶检测牛乳腺炎影响奶质量，严重的会引起人体中毒，因此需要严格控制原料乳中的乳腺炎感染状况。乳腺炎奶通常其乳酸的含量会增加数十倍。测量乳品中的乳酸含量不仅可控制原料乳的质量，还可追踪成品乳制品的产奶牛的健康状况。因此，乳品中乳酸的检测对于控制乳品质量具有非常重要的意义。34LUNDUNIVERSITY牛奶中的乳酸的检测Comparisonoftheresultsofbuffersamplesandmilksamples.(A)buffersamples,withflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.(B)1:1dilutedmilksampleswithflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.35LUNDUNIVERSITY分析结果•固相酶柱在34天后其活性维持在82.5%（每天测量0.5mM的乳酸数次）•牛奶样品（1：1稀释）的乳酸检测精度为62µM•检测线性范围0.06–1mM以上（用乳酸氧化酶）•检测时间5分钟/样品36LUNDUNIVERSITY奶中尿素的检测37LUNDUNIVERSITY两分析物检测原理多指标检测系统ReferencesignalMeasurementsignalCalorimetriccylinderPeristalticpumpWasteBufferInjectionvalveReferencecolumnMeasurementcolumnThermistorsReferenceprobe38LU