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三、转基因的检测•(一)遗传标记法–在表达载体中安装选择性基因•如对某种抗生素的抗性基因,对某种除草剂的抗性基因等–在表达载体中安装报告基因•转化处理过的受体在相同条件下都能生长,但转化体具有非转化体所不具有的某种特殊表现(称为显性的报告基因),或者转化体不具有非转化体的表现(称为隐性的报告基因)。1.利用选择性基因☆筛选植物转化细胞或转化植株常用的选择剂:抗生素类有卡那霉素、潮霉素B等;除草剂类有草甘膦、双丙氨膦、绿黄隆等。检测潮霉素抗性的叶片放入含一定体积(约30rn1)检测溶液的平皿中,在12h光照/12h黑暗、26℃条件下培养,定期观察叶片变色情况,以判断其抗性水平。检测溶液为含1mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)及100mg/L潮霉素B的水溶液.浸种培养至破胸时,分放在装有不同浓度G418溶液的培养皿中,培养皿底覆盖有两层滤纸。将培养皿置于光照培养箱内(光强为10,000μmol/m2/s,光照时间为12h/d,温度为29℃),观察种子发芽情况,7d后统计其发芽率和白化死亡率。每片叶剪成2cm左右长的叶段放入装有G418的培养皿中,将叶片置于室内室温下(光强约为10,000μmol/m2/s,光照时间约为12h/d,温度约为25℃),定期观察其变化情况。300mg/l80mg/l浸泡种子浸泡幼苗叶片喷施幼苗2.利用报告基因gus基因、萤火虫荧光素酶基因等,应用较为广泛的是gus基因,即β-葡糖苷酸酶基因。gus基因来自细菌,所编码的β-葡糖苷酸酶,与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡糖苷酸酯(简称为X-Gluc)的底物发生作用时,能产生蓝色沉淀反应。既可用分光光度计测定,又可直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点转基因愈伤组织的GUS显色0.5MEDTAsolution0.5MNa2HPO41MNaH2PO4100mMK4Fe(CN)6100mMK3Fe(CN)610%TritonX-100(Invitrogen)100μL10mM784μL158μL25μL0.5mM25μL0.5mM50μL0.1%100μLDMSOcontaining5.24mgX-Gluc2mM0.1MNaPO4buffer(PH7.4-7.6)GFP(GreenFluorescenceProtein)GFP395nm-470nm505nmYFP527nmCFP433nm476nm激发波长发射波长马丁·沙尔菲下村修钱永健2008年诺贝尔化学奖cyanfluorescentproteinyellowfluorescentprotein(二)分子生物学方法检测1、DNA水平(1)PCRCK转基因个体•模板template•引物primer•dNTP•Taq•反应缓冲液:离子Mg2+等1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度gDNA提取方法CTAB法SDS法(1)DNAextractionbuffer:finalconcentration0.35Msorbitol63.75gsorbitol(S29)山梨醇0.1MTris200mlof1MTris,pH7.55mMEDTA-Na210ml0.5MEDTAadddistillH2Oto1literAdjustpHto7.5withHCL.(2)Nucleilysisbuffer:finalconcentration0.2MTris200mlof1MTris,pH7.550mMEDTA-Na2100ml0.5MEDTA2.0MNaCl117gNaCl(S13)2%CTAB20gCTAB(C11)十六烷基三甲基溴化铵adddistillH2Oto1liter(3)5%sarkosyl:50gperliterofN-lauroylsarcosinesodiumsalt(L1).Prepareextractionbuffer:1vol.DNAextractionbuffer,1vol.Nucleilysisbufferand0.4vol.5%sarkosyl.Beforeuse,addNa-bissulfitetoaconcentrationof0.02M(3.8g/L).Mixgently,warmupto65℃iftooviscous.CTAB(1)取材料,加液氮研磨成粉末状,迅速移入1.5mlEppendorf管中;(2)加入800μl的CTAB提取缓冲液,混匀(CTAB在65℃水浴预热),每5min轻轻震荡几次,20min后12000r/min,离心15min;(3)小心吸取上清液,加入等体积的酚:氯仿(各400μl)溶液,混匀,4℃,12000r/min,离心10min;(4)小心吸取上清液,加入等体积的氯仿,混匀,4℃,12000r/min,离心10min。(5)重复步骤(4)1-2次,以蛋白层不出现为止;(6)取上清,-20℃沉淀1h,4℃,12000r/min,离心10min;(7)弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀2次;(8)室温下干燥后(一般干燥5-15min),溶于30-50μl去离子水中,于-20℃或者-70℃下保存备用。SDS方法提取gDNA研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。1、取幼嫩的组织材料1-2g,,加入液氮研磨至粉末状,加500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。2向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂,65℃保温10min,并不时摇动。3加入150μL5mol/LKAc,混匀,置冰上20-30min。44℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30min。512000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。6加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。7氯仿抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30min。12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。8用400μL70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。(2)核酸分子杂交法•核酸杂交探针:同位素标记等样品:转印好的膜温度:65℃缓冲液:SSC鲑鱼精DNA:扣除非特异杂交背景•一、提取基因组总DNA•二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广(200bp-50kb),实验成本低。1.制备0.8%凝胶:一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。2.电泳:电泳样品中加入6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。1-2V/cm,DNA从负极泳向正极。•四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物(一)试剂准备1.变性液:0.5MNaOH;1.5MNaCl。2.中和液:1MTris-HCl(pH7.4);1.5MNaCl;3.转移液(20×SSC):NaCl175.3g;柠檬酸三钠82.2g,NaOH调pH至7.0,加ddH2O至1000ml。(二)操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。2.中和:将凝胶转移到中和液15min。3.转移:转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)4.转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间,80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。•五、探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也很简单。以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤:1.取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴。2.在另一个0.5ml离心管中加入:Labeling5×buffer10μl(含有随机引物)dNTPmix2μl(含dCTP、dGTP、dTTP各0.5mM)BSA(小牛血清白蛋白)2μl[a-32P]dATP3μlKlenow酶5U3.将变性模板DNA加入到上管中,加ddH2O至50μl,混匀。室温或37℃1hr。4.加50μl终止缓冲液终止反应。•六、Southern杂交一般采取的是液-固杂交方式,即探针为液相,被杂交DNA为固相。1.预杂交NC膜浸入2×SSC中5min,在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8cm的膜加5ml即可),将膜的背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中,使杂交体系升到65℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA(已溶解在水或TE中)100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶中,使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点,降低杂交背景、提高杂交特异性。2.杂交倒出预杂交的杂交液,换入等量新的已升温至42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。七、洗膜与检测SSC和SDSNPMIP2OE-1MIP2OE-3MIP2OE-5MIP2OE-8MIP2OE-9NP利用SouthernBlot检测目的基因拷贝数(2)RNA转录水平RT-PCR和Q-PCR检测mRNAcDNAPCRAMIP1ACT05101520253035NPMIP1OE-2B蛋白水平-翻译水平是利用抗原-抗体特异结合原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成,是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法。WesternBlot详细过程•蛋白提取•SDS-PAGE电泳•转膜•杂交过程•显示结果:NBT/BCIP碱性磷酸酶标记DAB辣根过氧化酶标记荧光扫描仪电泳示意图返回返回WesternBlot步棸封闭(Blocking)转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。加入Western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体可以在4℃封闭过夜。一抗孵育(Primaryantibodyincubation)参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。或者在4℃缓慢摇动孵育过夜。洗涤3次。二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。洗涤3次蛋白检测(Detectionofproteins)参考相关说明书,使用BeyoECL,Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。•转化当代的外源基因整合和表达–表型证据–分子生物学证据•转基因生物的完整鉴定还需要提供以下证据–转化体当代性状表现的证据(如抗虫、抗病等)–转化体表型性状遗传的证据•有性繁殖作物应能传递到后代•无性繁殖作物繁殖一代应稳定遗传–以上各方面均要求设置严格的对照转基因的遗传一
本文标题:转基因鉴定与安全性评估
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