食品安全分析10

第十章维生素的测定海南大学食品学院第一节概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。维生素的分类1、脂溶性维生素：能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。2、水溶性维生素：能溶于水，包括B族、C，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出，需要每天供给。测定食品中维生素的含量的意义评价食品的营养价值；寻找富含维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件；监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。第二节脂溶性维生素的测定VA、VD、VE、VK与类脂物一起存于食物中。脂溶性维生素具有以下理化性质：1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2、耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定，VE对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3、耐热性、耐氧化性：耐热性好，VA易被氧化，光和热促进其氧化；VE易被氧化，对可见光稳定但易被紫外光氧化；VK易被光、氧化剂及醇氧化。根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。一、维生素A的测定维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。GB/T5009.82—2003中第一法高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素E。最小检出量分别为VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。（一）高效液相色谱法测定食物中VA、VE1、原理食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。2、分析步骤皂化→提取→洗涤→萃取→浓缩→溶解→离心→测定→结果计算（1）皂化称取1－10g样品（含维生素A约3μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加50mL10％抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL(1+1)氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。（2）提取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。（3）洗涤用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，水洗至水层不显碱性，（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。（4）浓缩将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55°C水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm)。上清液供色谱分析。（5）标准曲线的制备将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约1mg/mL），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法：取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。绘制标准曲线：标准和内标物进行色谱分析，以维生素A峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素A浓度为横坐标绘制标准曲线。（6）高效液相色谱分析预柱:ultrasphereODS10μm,4mm×4.5cm分析柱:ultrasphereODS5μm,4.6mm×25cm流动相:甲醇:水＝98:2混匀,于临用前脱气紫外检测器波长：300nm进样量：20μL流速：1.7mL/min（7）注意事项维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。GB/T5009.82—2003中第二法原理：在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。适用范围及特点：本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5—10μg／g)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰．不易比色测定：主要缺点：生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在6秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。（二）比色法测定VA的含量注意：维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀．因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。二、β—胡萝卜素的测定（GB/T5009.83—2003）第一方法是HPLC；第二方法为纸层析法。胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β—胡萝卜素效价最高。胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。β—胡萝卜素的结构如下：胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂镕性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β一胡萝卜素时，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。净化用层析介质采用氧化镁、氧化铝避光三、维生素D的测定维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，其中最重要的是D2和D3。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原，在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇。以D3为最重要。维生素D2药片吃多了中毒。分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。是AOAC选定的正式方法。维生素D的结构原理在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈正比。食品中维生素D含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化铝此法测定的是维生素D2和维生素D3的总量（一）三氯化锑比色法（二）液相色谱法灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。试样经皂化后，用苯提取不皂化物，蒸馏除苯，先采用反相C18柱分取维生素D，除去大部分杂质。进一步采用正相色谱分离，紫外检测定量。反相色谱条件色谱柱：NucleosilC18,7.5mm*300mm流动相：乙腈＋甲醇（1＋1）流速：2.0mL/min紫外检测波长：254nm正相色谱条件色谱柱：正相柱ZorbaxSIL,4.5mm*250mm流动相：0.4%异丙酮的己烷溶液流速：1.6mL/min紫外检测波长：254nm注意事项1、VD2与VD3分不开2、皂化时加入焦性没食子酸作为抗氧化剂2、标样与试样在同样条件下皂化，消除了VD的热异性化损失。3、也可用硅藻土及皂土柱层析，除去甾醇、VA、胡萝卜素的干扰。第三节水溶性维生素的测定水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常由饮食来提供。水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素Bl、B2盐酸水解酶解提取纯化维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好淀粉酶木瓜蛋白酶活性人造浮石硅镁吸附剂一、维生素B1的测定维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。分析方法：GB/T5009.84—2003中唯一的方法是荧光计法此法检出限0.05μg1、原理硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（噻嘧色素），在紫外线下，硫色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。从而测定其含量。2、分析步骤制样→水解→净化→氧化→干燥→测定→结果计算（1）提取精确称取一定量试样5－20g（硫胺素含量约为10－30ug）置于100mL三角瓶中，加入50－75mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解10.3×104Pa30min,凉后取出。用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5（以0.04%溴甲酚绿为指示剂）按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45－50℃温箱过夜保温（约16h）。冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液（2）净化用少许脱脂棉铺于层析柱的底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造沸石使之达到交换柱的三分之一高度。保持层析柱中液面始终高于活性人造沸石。用移液管加入提取液20－80mL（使通过活性人造沸石的硫胺素总量约为2－5μg）加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。加入25％酸性氯化钾（温度为90℃左右）20mL，收集此液于25mL刻度试管内，冷至室温，用25％酸性氯化钾定容至25mL,即为试样净化液。将20mL硫胺素标准使用液加入交换柱以代替样品提取液，即得到标准净化液。（3）氧化将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。在避光暗环境中将3mL15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B,振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。重复1－2，用标准净化液代替试样净化液。用黑布遮盖A、B反应瓶，