DB11T 1648-2019 樱桃砧木组培快繁技术规程

ICS65.020.20B05DB11北京市地方标准DB11/T1648—2019樱桃砧木组培快繁技术规程Technicalregulationforcherryrootstocksmicropropagation2019-06-18发布2019-10-01实施北京市市场监督管理局发布DB11/T1648—2019目次前言......................................................................................iii范围....................................................................................12规范性引用文件.........................................................................13术语和定义.............................................................................14容器、工具的清洗与灭菌................................................................25培养基的配制...........................................................................26外植体的选取及清洗.....................................................................27接种...................................................................................28初代培养...............................................................................39继代增殖培养...........................................................................310壮苗培养..............................................................................311生根培养..............................................................................412移栽过渡..............................................................................4附录A(资料性附录）......................................................................5附录B(资料性附录）......................................................................6IDB11/T1648—2019刖言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市园林绿化局提出并归口。本标准由北京市园林绿化局组织实施。本标准起草单位:北京市海淀区植物组织培养技术实验室、北京市植物组织培养工程技术研究中心、北京市林业果树科学研究院。本标准主要起草人：刘兰英、张军民、李春玲、杜建军、刘凤琴、张开春。IIDB11/T1648—2019樱桃砧木组培快繁技术规程1范围本标准规定了櫻桃砧木组培快繁过程中容器、工具的清洗与灭菌，培养基的配制，外植体的选取及清洗，接种，初代培养，继代増殖培养，壮苗培养，生根培养，移栽过渡等技术要求。本标准适用于海櫻系列、蓝丁系列和吉塞拉系列櫻桃砧木苗的组织培养快速繁殖。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2306—2013花卉种苗组培快繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1外植体explant从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。[NY/T2306—2013，定义3.8]3.接种inoculation将消毒后的外植体在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。改写NY/T2306—2013，定义3.3。初代培养primaryculture消毒后的外植体接种在无菌培养基中进行培养，获得初级无菌植物材料的培养阶段。3.4继代subculture将培养材料从老培养基中转接入新鲜培养基中继续培养的过程。[NY/T2306—2013，定义3.2]1DB11/T1648—20193.5丛生芽clusterbuds组织培养过程中诱导植物器官或愈伤组织产生的簇状芽。3.6并瓦苗invitroplantlet组织培养过程中生长在培养容器中的无菌苗。4容器、工具的清洗与灭菌培养容器和接种工具的清洗应符合NY/T2306—2013中6.1、6.2的要求，灭菌应符合NY/T2306—2013中8.1、8.2、8.4的要求。5培养基的配制櫻桃砧木组培快繁所选用的基本培养基是MS培养基，MS培养基的成分和含量参见附录A。不同培养阶段添加植物生长调节剂的培养基配方参见附录B。培养基的配制和灭菌应符合NY/T2306—2013第7章的要求。6外植体的选取及清洗6.1外植体母株选取选择品种纯正、来源可靠、生长旺盛、无病虫害的优良植株作为外植体的母株。6.2外植体采集6.2.1可于2〜3月从母株上选取健壮的一年生枝条，放在20°C〜25°C的房间内水培，每天换水，待枝条上叶芽萌发至2cm以上时，剪下作为外植体备用；也可于5〜9月选取母株上半木质化的新梢作为外植体备用，宜在植物表面露水干后采集新梢。6.2.2采集的外植体宜用塑料袋包装并做好品种标记，低温储运。6.3外植体清洗去除外植体叶片，根据节间长短剪取带1〜2个芽的2cm〜3cm茎段，用中性洗涤剂溶液将外植体表面洗净，流水冲洗10min〜30min，备用。7接种7.1接种前准备提前30min打开超净工作台、操作间、缓冲间和更衣间等处的紫外灯进行消毒，同时打开电热灭菌器。关掉紫外灯后，超净工作台宜开启10min〜20min后使用。2DB11/T1648—2019接种人员穿戴好专用鞋、工作服、帽子和口罩进入接种室。将手、台面、接种工具用75%酒精擦拭，将接种工具插入电热灭菌器灭菌，灭菌后置于搁置架上冷却、备用。72接种操作7.2.1将清洗后的外植体转移到无菌瓶中，倒入75%酒精直至没过外植体表面，轻摇瓶身30s〜60s后将酒精倒去，用无菌水冲洗外植体1〜2遍。7.2.2用0.1%升汞消毒液浸没外植体材料，消毒5min〜10min，浸泡过程中不断轻摇瓶身，消毒结束后，倒出并回收消毒液，外植体材料用无菌水清洗3〜4遍。7.2.3消毒后的外植体置于放有消毒滤纸的培养皿中，待吸干表面水分后，底端向下竖直插入到芽诱导培养基上，及时盖紧瓶盖或封口并扎紧。培养基配方参见附录B。7.2.4将植物品种代号、培养基代号、接种日期及接种人等信息标示到培养瓶上。8初代培养将接种好外植体的培养瓶放入温度为25°C±2°C的培养室进行培养，光照强度1500Lux〜2500Lux，光照时间10h/d〜12h/d，培养周期为30d左右。培养过程中每周要检查1〜2次，发现外植体褐化、污染、死亡时应立即剔除。9继代增殖培养9.1继代前准备将要继代的培养瓶表面用75%的酒精擦拭消毒。其它准备见本标准7.1条。9.2继代操作9.2.1在超净工作台台面上距外侧边缘10cm〜20cm处打开培养瓶瓶盖，从母瓶中取出要继代的瓶苗，去除基部褐化的组织和部分叶片。9.2.2把大的丛生芽团切割成单芽或含2〜4个芽的芽丛，转接到新配制的増殖培养基上。单芽高度为1cm左右；牙丛每个牙高可小于1cm。9.2.3每个培养瓶内转接芽的数量因培养容器大小而异，直径7.5cm〜8cm、容积350mL〜370mL的培养瓶中可转接8株/瓶或5丛/瓶左右。转接芽基部插入培养基0.5cm左右，分布均匀，及时盖紧瓶盖或封口并扎紧。9.2.4将植物品种代号、培养基代号、继代日期及人员信息标示到培养瓶上。9.3增殖培养将继代转接好的瓶苗放入温度22C±2C的培养室培养，光照强度1500Lux〜2500Lux，光照时间10h/d〜12h/d左右，培养周期为30d左右。培养过程中每周至少检查1次，发现污染应立即剔除；在下次继代前记录増殖倍数。10壮苗培养对生根培养前高度小于2cm的瓶苗，可进行一次壮苗培养。其它操作见本标准第9章。3DB11/T1648—201911生根培养将高度为2.0cm〜3.0cm的单芽转接到生根培养基上，直径7.5cm〜8cm、容积350ml〜370mL的培养瓶中可转接10株/瓶左右。其它操作见本标准第9章。12移栽过渡12.1移栽前准备宜选择温度、光照、湿度可调控的温室作为移栽过渡的场所。移栽前应对环境进行消毒，消毒方法参见附录C。宜选择草炭和蛭石作为基质。在容器中先装入1/2草炭，上面再铺一层蛭石，用0.5g/L的多菌灵溶液将基质浇透后备用。12.2移栽12.2.1将长出3〜5条不定根的瓶苗从培养容器中取出，放入清水中洗去培养基，沥水后进行移栽。12.2.2移栽时在基质上打孔，孔距2cm左右，孔大小以可容纳组培苗根系为宜。将根系植入孔内，覆土至组培苗根颈处，稍压实，保持苗不倾斜。12.2.3栽好后插上牌子，写明品种和移栽日期。12.3管理12.3.1温室内温度宜控制在20°C〜28°C。12.3.2移栽后2周内相对湿度宜控制在90%左右，移栽后3〜4周可逐渐降低相对湿度，4〜6周后相对湿度可保持在60%左右。12.3.3移栽后4周内光照强度宜为4000Lux〜7000Lux，之后可逐渐増大光照强度至自然光。12.3.4每周喷施80%多菌灵可湿性粉剂1500倍液1次，于苗上方15cm处均匀悬挂诱虫板。4附录A(资料性附录）MS培养基成分和含量DB11/T1648—2019MS培养基成分和含量见表A.1表A.1MS培养基成分和含量名称MS培养基成分含量(mg/L)大量元素硝酸钾KN〇31900硝酸铵NH4NO31650氯化钙CaCl2•2H2O440硫酸镁MgS〇4•脚370磷酸二氢钾KH2PO4170铁乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3盐硫酸亚铁FeS〇4•脚27.8硫酸猛MnS〇4•4H2O22.3微硫酸锌ZnSO4•脚8.6量硼酸H3BO36.2碘化钾KI0.83兀钼酸钠素NaMoO4•2H2O0.25硫酸铜CuSO4•5H2O0.025氯化钴CoCl2•6H2O0.025肌醇CH1A100有甘氨酸C2H5NO22.0机烟酸C^5NO20.5物盐酸吡哆辛（VBJC8HnNO3-HCl0.5盐酸硫胺素（VBi)C12H17QN4OS-HQ0.15DB11/T1648—2019附录B(资料性附录）组培各阶段的培养基配方组培各阶段的培养基配方见表B.1.表B.1组培各阶段的培养基配方用途基本培养基6-BA(mg/L)NAA(mg/L)糖(g)琼脂(g)注意事项芽诱导培养基MS0.50306.0宜用不透气膜封瓶口增殖培养基MS0.5〜1.00〜0.1306.0壮苗培养基MS0〜0.50.1〜0.2306.0宜用透气膜封瓶口生根培养基1/2MS00.5〜1.0206.0琼脂的强度为401g/cm2〜800g/cm2;壮苗培养基中加活性炭1.0g/L6DB11/T1648—2019附录C(资料性附录）温室环境的消毒方法温室环境的消毒方法见表