腺相关病毒知识

第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associatedvirus,AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类（Dependovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinsonetal.1965）,顾而得名。从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hogganetal.1966;Bulleretal.1981）。因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotinetal.1990,1991,1992;Samulskietal.1993）。研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinogluetal.1988;Yakobsonetal.1987,1989;Bantel-Schaaletal.1992,1991）。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a,E1b,E2a,E4和VARNA（Muzyczka1992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（WeindlerFetal.1991）。这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。目前的关于AAV工作模式有以下要点：（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；（2）通过潜伏感染,病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。返回标题第二节AAV病毒的基因组结构和功能人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。AAV-2基因组的结构如图3-1所示。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（invertedterminalrepeat,ITR）。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。一．ITR的结构和功能AAV病毒ITR的序列和结构见图3-2。每个ITR长145bp。其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小回纹结构（palindrome）（图2B和C）组成，旁边为一个较大的回纹结构（A）。ITR的序列可有两种构型：flip（B回纹接近3’端）或flop（C回纹接近3’端）。一个特定分子AAV的两个末端形成flip或flop的机率都相等。单链形式的AAVITR容易形成如图2所示的T型发夹结构，还可能形成另外的构型。ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。二．Rep基因的结构和功能Rep基因编码至少4种非结构蛋白：Rep78,Rep68,Rep52,Rep40。由p5启动子起始的2种mRNA翻译成Rep78和Rep68；p19启动子起始的2种mRNA翻译成Rep52和Rep40（图3.1）。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68相同。Rep78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关。这两种蛋白都可以和ITR中的特定序列(5’-GCTCGCTCGCTC-3’)结合。类似的序列在AAV的3个启动子上游均可找到。当ITR自我折叠时可加强这种结合作用。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。当其与ITR结合时便成为在124位点核苷酸处特异切割的缺口酶,识别的位点是5’-T/TGG。这两种蛋白对于AAV生活周期的每一时期都是必需的。在非允许条件下（没有辅助病毒和刺激因素），Rep蛋白只有微量表达，这种表达又能抑制其进一步的表达。另外，在非允许条件下Rep的表达似乎可抑制AAV基因组以直接方式复制。近来的研究证明Rep蛋白的表达对位点特异性整合是必需的。相反，在允许条件下，Rep蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAVDNA的复制都是必需的。Rep52和Rep40参与了病毒的装配，它们在病毒双链DNA合成中是不需要的，但在单链DNA和病毒颗粒的累积中则是必需的。三．Cap基因的结构和功能Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kbmRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3(图2)，分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。返回标题第三节重组AAV的产生原理及常规制备、检测方法在基因治疗研究中，重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。但近年来这一情况有所改变，用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。这是由于AAV具有以下特点：（1）安全性好。迄今从未发现野生型AAV对人体致病;重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；（2）宿主范围广。不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3）野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体;（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术进行操作；（5）物理性质稳定。在60°C不能被灭活,能抗氯仿;（6）重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。一．重组AAV的产生原理目前在基因治疗研究中所用的AAV载体均由2型AAV改造而来。AAV-2的ITR中包含了复制、包装、拯救及整合的信号，这使rAAV的产生成为可能：外源基因表达盒可完全取代AAV的编码序列，rep和cap基因产物则可由另一个质粒反式提供。参照野生型AAV的生活周期，表达外源基因的rAAV的产生需要4种成分参与：1.载体DNA。载体DNA质粒包括了145bp的AAVITR序列，外源基因的表达单位（通常由转录启动子、目的基因和多聚腺苷酸序列组成）位于两个ITR之间。2.AAV的复制蛋白(Rep)和外壳蛋白(Cap)。通常由携带它们相应基因的质粒（称为包装质粒）反式提供。3.宿主细胞。多种细胞可用作产生重组AAV的宿主细胞，包括293细胞、HeLa细胞和KB细胞等，其中293细胞用磷酸钙转染的效率最高，因此最常用。4.辅助病毒。常用的辅助病毒为腺病毒，疱疹病毒则较少用到。腺病毒的辅助功能由E1a、E1b、E2a、E4orf6和VARNA基因提供；HSV-1的辅助功能由UL5、UL8、UL52和UL29等基因提供。在辅助病毒存在的条件下，Rep蛋白可以将含有外源基因表达单位的rAAV基因组从载体质粒上拯救出来，并加以复制，得到大量复制形式的rAAVDNA。随后，Cap蛋白可将单链的rAAV基因组包装成感染性的病毒颗粒。二．重组AAV的常规制备及纯化方法rAAV载体的常规制备过程见图3.3。通常采用磷酸钙共转染的方法，将载体质粒和包装质粒共转染经腺病毒感染的HeLa或293细胞(HermonatandMuzyczka,1984;Samulskietal.,1987,1989)。当细胞在腺病毒感染下完全病变后（通常为感染后48-72h），收集细胞，低速离心、去上清。此时绝大部分rAAV存在于细胞内，去掉上清没有明显损失。将细胞团块冻融3~4次，裂解液在55~60°C加热30~60min以灭活腺病毒。低速离心去除细胞碎片后，将rAAV的粗提物用若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化。如果rAAV基因组与野生型AAV基因组的大小一致，则密度为1.41g/cm3,可以与密度为1.35g/cm3的腺病毒明显分离。对于转导培养的细胞，用rAAV的粗提物即可；但如果用于动物实验，则需进行若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化，因为即使污染了很少量的腺病毒（无论灭活与否）都能造成病毒接种部位的局部炎症反应。在rAAV制备过程中，需注意以下问题：1．rAAV的基因组长度（包括两个ITR在内）应接近野生型AAV基因组4681bp的长度，即外源基因表达盒（包括启动子、目的基因及多聚腺苷酸序列）不超过4.3kb。2．AAV的ITR在大肠杆菌中不稳定，在大量制备rAAV载体质粒后，检测ITR的完整性是很重要的。由于在ITR内部含有SmaI的酶切位点，因此用SmaI对载体质粒进行酶切，通过获得的片段即可初步判断ITR是否完整。通常制备的质粒中，≤20%的质粒会丢失一个ITR,这在rAAV的制备中是可以接受的。3．rAAV的产量取决于转导效率。用优化的磷酸钙转染方法对293细胞的转染率可接近100%，但必须保证DNA沉淀颗粒细小、均一，转染液的pH稳定。转染效率可以通过转染含报告基因（β-半乳糖苷酶基因或绿色荧光蛋白基因）表达盒的质粒来检测。4．腺病毒感染的进程对rAAV的产量有很大影响。如果在感染后60h,细胞恰好完全病变并开始脱离培养皿，这种情况下rAAV的滴度最高。如果腺病毒感染的进程过快，细胞不久就脱离培养皿，rAAV的产量就不会高，这种情况下应降低腺病毒的感染指数（multiplicityofinfection,MOI）。三．重组AAV的滴度测定方法rAAV的滴度测定可根据情况采用以下不同的方法进行。1．测定外源基因表达测定外源基因的表达是确定rAAV滴度的最严格的方法。阳性转导信号表明rAAV成功地感染了细胞、脱壳、外源基因得到了表达，而且表达水平足以用合适的方法检测到。然而，由于在不同的外源基因表达的检测上没有统一的标准，因此携带不同基因的rAAV在产量上不便比较。2.复制中心检测（replicationcenterassay,RCA）在该项检测中，已向细胞提供了rAAV复制所必需的全部成分：用野生型AAV提供了AAV的Rep和Cap蛋白，用腺病毒提供了辅