高致病性禽流感疫情处置技术规范

农业部关于印发页码，1/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8　　农业部关于印发《高致病性禽流感疫情处置技术规范（试行）》的通知农政发[2004]1号2004年2月3日　各省、自治区、直辖市农业、农垦、畜牧、渔业、乡镇企业、农机化厅（局、委），新疆生产建设兵团农业局：　　《高致病性禽流感疫情处置技术规范（试行）》已经2004年2月2日农业部第7次常务会议审议通过，现印发你们，请遵照执行。　　高致病性禽流感疫情处置技术规范（试行）　第一项样品采集、保存及运输技术规范　　采集、保存和运输样品应当符合下列要求，并填写采样单。　　一、样品采集　　　（一）病禽　　　1．至少从5只濒死禽采集样品。样品包括：泄殖腔拭子和气管拭子（置于缓冲液中）各5个（小珍禽可采集新鲜粪便）；气管和肺的混样5个，肠管及内容物的混样5个；肝、脾、肾和脑等组织样品（不能混样）各5个。　　2．分别采集至少10个病鸡的血样（急性发病期血清）。　　（二）病死禽　　无发病禽时，可从死亡不久的病禽采样，采样要求同病禽。　　棉拭子单独放入容器，容器中盛放含有抗菌素的pH值为7.0-7.4的PBS液。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）、制霉菌素（10000IU/mL）。但粪便和泄殖腔拭子所用的抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后pH值应调至7.0-7.4。　　二、样品保存和运输　　血样要单独存放，不能混合。　　　样品应密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷剂的容器中运输，容器必须密封，防止渗漏。　　　样品若能在24小时内送到实验室，冷藏运输。否则，应冷冻运输。　　若样品暂时不用，则应冷冻（昀好-70℃或以下）保存。　采样单　农业部关于印发页码，2/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8　　此单一式三份，第一联存根，第二联随样品，第三联由被采样单位保存　第二项血清学诊断技术规范　　一．血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术　　　（一）材料准备　　　1．96孔V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。　　2．阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录A。　　3．pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。　　4．高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。　　（二）操作方法　　1．血凝（HA）试验（微量法）　　（1）在微量反应板的1-12孔均加入0.025mLPBS，换滴头。　　（2）吸取0.025mL抗原加入第l孔，混刀。　　（3）从第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混刀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。　　（4）每孔再加入0.025mLPBS。　　（5）每孔均加入0.025mL1%（V/V）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇刀后加入）。　　（6）振荡混刀，在室温（20℃-25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下1hr）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。　　（7）结果判定。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒昀高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。样品名称 样品编号 采样基数   采样日期   被采样单位 通讯地址 联系电话 邮 编 　    被采样单位盖章或签名　     年 月 日　 采样单位盖章采样人签名　       年月日　 备注：　　　农业部关于印发页码，3/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8　　2．血凝抑制（HI）试验（微量法）　　（1）根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒昀高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64（256除以4）。　　（2）在微量反应板的1-11孔加入0.025mLPBS，第12孔加入0.05mLPBS。　　（3）吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混刀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。　　（4）1-11孔均加入含4HAU混刀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。　　（5）每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混刀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1hr），对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。　　　（三）结果判定　　　以完全抑制4个HAU抗原的血清昀高稀释倍数作为HI滴度。　　只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价等于41og2为阳性。　　二．琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验　　　（一）材料准备　　　1．硫柳汞溶液、pH7.2的0.01mol/LPBS溶液，配制方法见附录B。　　　2．琼脂板：制备方法见附录C。　　　3．禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。　　（二）操作方法　　　1．打孔。在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm，孔距2mm-5mm，将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。　　　2．封底。用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要溶化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。　　3．加样。用微量移液器或带有6～7号针头的0.25mL注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔（图1的⑦号），标准阳性血清分别加入外周的①和④孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔（图1的②，③，⑤，⑥号孔）。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。　　　4．作用。加样完毕后，静置5min～10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。　　　（三）结果判定　　　1．判定方法。将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清（图1的①和④号孔）与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。　　　2．判定标准　　　（1）若被检血清孔（如图1中的②号）与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。　　　（2）被检血清孔（如图1中的③号）与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清孔（如图1中的④号）的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性）。　　　（3）若被检血清孔（如图1中的⑤号）与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。农业部关于印发页码，4/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8　　（4）被检血清孔（如图1中的⑥号）与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。　　图1AGP试验结果（略）　附录AHA和HI试验用溶液的配制　　　1．阿氏（Alsevers）液配制　　　葡萄糖2.05g　　　柠檬酸钠0.8g　　　柠檬酸0.055g　　　氯化钠0.42g　　　加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。　　　2．1%鸡红细胞悬液制备　　　采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/LPBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，4℃保存备用。　附录BAGP试验用溶液的配制　　　1．1%硫柳汞溶液的配制　　硫柳汞1.0g　　　加蒸馏水至100mL　　　溶解后，置100mL瓶中盖塞存放备用。　　　2．pH7.2的0.01mol/LPBS的配制　　　（1）配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g二水磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL。　　　（2）配制1×PBS：量取40mL25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。　　　（3）用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。　　　（4）灭菌或过滤。　　　（5）PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。　　附录C琼脂板的制备　　　称量琼脂糖1.0g，加入100mL的pH7.2的0.01mol/LPBS液，在水浴中煮沸使之充分融化，加入8g氯化钠，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL，冷至45℃-50℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL-20mL，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。　农业部关于印发页码，5/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8第三项高致病性禽流感诊断标准　　一、诊断指标　　　（一）临床诊断指标　　　1．急性发病死亡；　　　2．脚鳞出血；　　　3．鸡冠出血或发绀、头部水肿；　　　4．肌肉和其他组织器官广泛性严重出血。　　　（二）血清学诊断指标　　　1．H5或H7的血凝抑制（HI）效价达到24及以上；　　　2．禽流感琼脂免疫扩散（AGP）试验阳性（水禽除外）。　　　（三）病原学诊断指标　　　1．H5或H7亚型病毒分离阳性；　　　2．H5或H7特异性分子生物学诊断阳性；　　　3．任何亚型病毒静脉内接种致病指数（IVPI）大于1.2。　　二、结果判定　　　（一）临床怀疑为高致病性禽流感　　　符合临床诊断指标1，且至少有临床诊断指标2、3、4之一。　　（二）疑似高致病性禽流感　　　符合结果判定（一），且符合血清学诊断指标1或/和2。　　　（三）确诊　　　符合结果判定（二），且至少符合病原学诊断指标1、2、3之一。　第四项封锁技术规范　　一、由所在地畜牧兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。　　　二、封锁令的发布：畜牧兽医行政管理部门报请本级人民政府对疫区实行封锁，人民政府在接到报告后，应立即做出决定。决定实行封锁的，发布封锁令。　　　三、封锁的实施：当地人民政府组织对疫区实施封锁。在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口建立临时性检疫消毒站，指派专人，配备消毒设备，禁止易感染活禽进出和易感染禽类产品运出，对出入人员和车辆进行严格消毒。　　　四、封锁令的解除：疫区内所有禽类及其产品按规定处理后，经过21天以上的监测未出现新的传染源，且受威胁区病原检测阴性，经动物防疫监督人员审验合格后，由当地畜牧兽医行政管理部门向发布封锁令的人民政府申请解除封锁。　第五项扑杀技术规范　　　扑杀活禽可采取如下方法：　　　一、窒息　　　先将待扑杀禽装入袋中，置入密封车或其它密封容器，通入二氧化碳窒息致死；或将禽装入密封袋中，通入二氧化碳窒息致死。　　二、扭颈　　　扑杀量较小时采用。根据禽只大小，一只手握住头部，另一只手握住体部，朝相反方向扭转拉伸。　农业部关于印发页码，6/8~laws/htm/g0000938.htm2004-10-8　　三、其它　　　也可根据本地情况，采用其它能避免病原扩散的致死方法。　第六项无害化处理技术规范　　　所有病死禽、被扑杀禽及其产品、排泄物以及被污染或可能被污染的垫料、饲料和其他物品应当进行无害化处理。　　　无害化处理可以选择深埋、焚化、焚烧等方法，饲料、粪便也可以发酵处理。　　　一、深埋　　　1．深埋点应远离居民区、水源和交通要道，避开公众视野，清楚标示。　　　2．坑的覆盖土层厚度应大于1.5米，坑底铺垫生石灰