第七章发酵过程中工艺参数的检测和控制

第七章发酵过程中工艺参数的检测和控制发酵涉及到微生物学、生物化学及发酵工艺学知识。要想获得高产，对生产菌的生活规律要充分了解。除了生产经验外，还需要科学的检测手段。第一节工业发酵的重要类型第二节发酵过程的主要控制参数第三节菌体及基质浓度对发酵的影响及控制第四节溶氧的浓度对发酵的影响及控制第五节pH对发酵的影响及控制第七章发酵工艺控制第六节温度对发酵的影响及控制第七节二氧化碳对发酵的影响及控制第八节补料及泡沫对发酵的影响及控制第九节工业发酵染菌的防治第十节发酵终点的判断第一节工业发酵的主要类型一、按投料方式分微生物培养有三种方式，分批、连续培养和分批补料。二、按菌体生长与产物形成关系分微生物发酵过程中的动力学类型类型I、类型II、类型III第一节工业发酵的主要类型㈠分批发酵法(batchfermentation)分批发酵又称分批培养，发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。第一节工业发酵的主要类型（二）连续发酵法(continuousfermentation)在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中的菌体进行连续生长和发酵。Flash1第一节工业发酵的主要类型（三）补料分批发酵法(fed-batchfermentation)补料分批发酵又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。☆第一节工业发酵的主要类型二、按菌体生长与产物形成关系分微生物发酵过程中的动力学类型类型I、类型II、类型III微生物发酵过程中的动力学类型比速率：是1克细胞每小时形成产物的克数或每克细胞每小时利用糖的克数（g/g.h）或每克细胞每小时繁殖细胞的克数。类型I：菌体的生长、碳源的利用与产物形成的比速率曲线均有一个高峰，且高峰基本上在相同的时间出现。如单细胞蛋白生产等。类型II：可粗略的分为两个节段，在发酵的第一期菌体迅速生长，产物形成很少或全无，在第二个阶段产物高速形成，菌体生长和糖耗也相应增加。如柠檬酸和某些氨基酸发酵。类型III：生长和产物是来自两个代谢途径，而不是来自分解代谢途径，在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成产物，也就是，初级代谢和产物形成是完全分开的，如许多抗生素发酵。Flash2第二节、发酵过程的主要控制参数工厂设备越先进，产品附加值越高，检测的参数就越多。但工厂生产讲究越简单越好。发酵控制一般分为物理、化学、生物三类。一、物理参数1．温度：最适生长温度，它与酶反应速率，氧的溶解、产物合成都有关。①如四环素生产菌在30℃时合成金霉素，35℃时，只产生四环素，合成方向会改变。②生长温度与合成温度不同。如青霉素，生长30℃，合成24.7℃。2．压力（Pa，帕斯卡）。98070Pa=1Kg/cm21Mpa﹦103Kpa=106Pa。灭菌压力1Kg/cm2=0.11Mpa。发酵罐压一般为0.02~0.05Mpa。3．搅拌转速（r/min）。罐体积转速（r/min）通风量（m3/m3.min）50L5501：0.650000L1101：0.12一般来说，假如小罐与大罐的几何相同。但为什么转速会相差这么大？原因大罐气液接触时间长，氧的溶解率高，搅拌和通气均可小些，一、物理参数4．搅拌功率（KW）P/VKW/m3生产上：一般用瓦特计直接测量电动机的耗用功率，从中减去各项传动摩擦所损耗的功率。对小罐，误差较大。用电阻应变式动力计测量。一、物理参数5．通气量（V/V.min）气体流量用转子流量计测量。用m3/m3.min，指每分钟每立方米发酵液通进1立方米空气，用1︰1表示。如柠檬酸1︰0.15，而青霉素1︰1。6．粘度Pa·s(秒）Pa=1N/m2是细胞生长和细胞形态的一项标志，它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体的浓度。7．浊度：反映单细胞生长状况的参数。如大肠杆菌，用光密度650nm上检测或计数板计数。8．料液流量（L/min）这是控制流体进料的参数。二、化学参数1．PH：发酵过程中产酸或产碱的生化反应的综合结果。细菌是多少？酵母、霉菌、放线菌？二、化学参数2．基质浓度：指营养成分的浓度，发酵过程中必须定时测定还原糖，总糖，磷酸盐、氮（氨基酸或氨氮）等基质的浓度。二、化学参数3．溶解氧浓度：mmol/L,mg/L,ppm或用%（指饱和浓度的百分数）表示。利用它的变化可了解生产菌对氧利用的规律也能反映发酵的异常情况。科研上用于检测设备供氧能力的指标。二、化学参数5．产物的浓度：ug/ml，生产中合成期产物的浓度需要测定，如柠檬酸生产用NaOH滴定，抗生素用抑菌圈大小测定。二、化学参数6．废气中氧和二氧化碳的浓度：用顺磁氧分析仪测定氧气的浓度，用红外二氧化碳分析仪测定二氧化碳浓度，如氧气减少和二氧化碳增加表明是好氧代谢的结果。三、生物参数1.菌丝形态：观察菌丝形态是生产中最常用的方法。每隔8小时镜检，能及时发现异常染菌。如青霉素生产，生产菌生长分为I.孢子发芽，II.菌丝增殖，III.菌丝分枝旺盛，出现脂肪颗粒，IV.菌丝生长减缓，细胞内出现小气泡，V.气泡增大，颗粒消失，产物形成，VI.气泡延伸，菌丝自溶。2.菌体浓度：测定方法有三种：A.湿重法：量100ml发酵液，进行过滤，滤后菌体用水洗净，然后用吸水纸将水分挤干，直接称量。B.干重法：上述步骤菌丝放85℃烘干至恒重。C.体积法：取样品10ml放于刻度离心管内，用转速为3000转/分离10min，计算%（V/V）。固体原料也在其中，但如培养基组成不变条件下，具有相对准确性。第三节菌体及基质浓度对发酵的影响及控制3.1菌体浓度对初级产品来说，菌浓愈大，产量愈高，但菌浓符合生长曲线。象柠檬酸生产由糖转化成酸。次级产品如菌浓过大，由于代谢产物的积累，会影响产量。因其产品与原料并非对应（或底物抑制，分介产物抑制等）。①C源，青霉素生产中葡萄糖和乳糖利用。因此工业上培养基中含有迅速和缓慢利用的混合C源。如为聚合物，利用缓慢。3.2基质浓度②N源，也有迅速利用和缓慢利用，前者有氨基酸、硫酸铵、尿素和玉米浆，后者有黄豆饼粉、花生、棉子饼粉等蛋白质。前者菌生长快，但产量低，选用快、慢混合氮源很重要。生产上可补加有机或无机氮源。3.2基质浓度•③磷酸盐：P是核酸，许多辅酶，ATP，组成部分，P对微生物生长、代谢有重要作用。•工业多以供应KH2PO4、K2HPO4为磷源，配料时，KH2PO4计算，每克KH2PO4理论磷含量227毫克，如将其溶在1L水中，就是227ppm。用链霉菌生产四环素时，菌体生长最适磷为65-70ppm，合成为25-30ppm。★•测定方法：磷与钼酸铵（NH4）2M0O4作用，生成磷钼酸铵，在酸性条件下，用VC还原，生成钼蓝，然后比色。3.3基质浓度的控制分批补料培养（fed-batchculture,简称FBC），是指在分批培养过程中，间歇和连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。有报道四环素发酵不补料的话，培养72-96h，发酵单位5500-7000单位/mL，而补糖的批号，发酵周期延长到120-130h，单位提高到10000-12000u/ml。①避免一次投料，菌丝生长过盛。②延长次级代谢产物的分泌期，提高产量。中间补料的机理☆FBC的内容①补碳源、氮源（无机和有机），如蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素。②无机盐，微量元素，前体和促进剂。③补全料和补水，总之视情况不同，补单项还是全部。补料的时间和方式补料的时间很重要，有人研究加糖时间对四环素发酵单位的影响。接种20h45h62h产量6000u/ml10000u/ml5000u/ml一般认为，过早补糖，可能刺激菌丝生成，加速糖的利用，过迟补糖，可能菌丝的内在质量已受到一定损害，补糖只是干扰代谢并不能提高产量。补料的时间和方式补料的方式：①小量间隙多次补入。②小量连续滴加补入。③大量多次补入或大量少次补入等。补料的实例:如庆大霉素生产，大罐总体积20吨，第一次装料7吨，接种后15h一次性补5吨，然后在30-60h中小量间隙多次补入6吨料（全料），视生长情况决定是否在80h补适量水。总周期120-130h。一、溶氧的浓度对发酵的影响微生物对氧的需求：1、C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+能量从分子式看出，180g葡萄糖完全氧化需190克O2。2、构成细胞成分含有氧，如酵母细胞元素组成为C3.95N6.5O1.94。第四节溶氧的浓度对发酵的影响及控制O2在水中的溶解度很低。如在25℃，1个大气压下O2溶解在水中的量为0.2mmol/L，或6.4mg/L。而微生物需氧量20—50mmol/L.h，正常情况下，只能维持20—50秒钟,水中氧消耗完。怎么供氧呢？用纯O2输入发酵罐，效果好，但O2在水中的溶解度较低，大多跑了，成本高，没有实用价值。返回基本概念：1、微生物摄氧率（γ）mmolO2/（L．ｈ）单位体积培养液每小时消耗的氧量。２、呼吸强度（Ｑo2）mmolo2/[g（干菌体）.h]单位重量的干菌体每小时消耗的氧量。两者关系γ=Qo2.XX—发酵液中菌体密度（g/L）。临界氧浓度3.临界氧浓度：微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个最低要求，这个浓度叫临界氧浓度。临界氧浓度①不同微生物C临界不同，见下表：菌种温度.℃C临界（mg/L）大肠杆菌37.80.26酵母菌34.80.15产黄青霉240.7表明青霉菌摄氧率高，发酵时空气通气量大。②同一种菌生长不同阶段C临界不同。如幼龄菌大于老龄菌另外一般生产菌都是：生长期大于合成期的临界氧浓度。二、氧在液体中的溶解特性饱和浓度：气体与液体相接触，气体分子就会溶解于液体之中。经过一段时间的接触，气体分子在气液两相中的浓度就会达到动态平衡。溶解氧的饱和浓度（C*）的单位可用mmolo2/L、ppm、和mgo2/L。影响氧饱和浓度的主要因素有：二、氧在液体中的溶解特性（一）温度：工业产品大多是随着温度升高，溶解度增加，；利用这个特点得到晶体。如柠檬酸、葡萄糖等。而O2正相反，温度增加，C降低。温度（℃）0℃35℃溶解度（mmolo2/L）2.181.09（纯氧）（二）溶液的性质：氧在不同性质的溶液中的溶解度是不同的。同一种溶液由于其中溶质含量不同，氧的溶解度也不同。盐酸0.5mol1mol2mol1.211.161.12溶质含量越高，氧的溶解度就越小。氧在液体中的溶解特性（三）氧分压；亨利公式：C*=H-1×Po2C*—在平衡状态下液体中氧的溶解度（mmolo2/L）Po2—氧分压MPaH—亨利常数MPa×L/mmolo2从公式中可知C*与Po2成正比。气相中氧的浓度取决大气压和①纯氧；②罐压提高，Po2提高。C*增大，但不能太高，纯氧也可提高。③利用吸氮装置，减少空气中的氮气，增加氧含量。理论上，发酵过程中：温度越低，C*越高，溶质越稀，C*越高，罐压越高，C*越大。但工业上应用都受到限制。三、氧在溶液中的传递•N=KLa（C*—CL)•式中•N——氧的传递速率，mmolO2/h；•C*——溶液中饱和溶氧浓度，mmolO2／L；•CL——溶液主流中的溶氧浓度，mmolO2／L；•KLa——以浓度差为推动力的氧传质系数，1／h；•a——比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积m2／m3）。因为a很难测定，所以将L当成一项，称为液相体积氧传递系数，1／h四、氧的传递方程式•N=KLa（C*—CL)•双膜理论：•是气体吸收的基本理论：P—空气中的分压；Pi—界面处氧分压；P—Pi称为推动力（气相）Ci—界面处氧的浓度；CL—液相中氧的浓度；Ci—CL为液相推动力。在稳定传质过程中通过双膜的传氧速率N应相等。N=KGa（P—Pi）=KLa（Ci—CL）由于Pi和Ci无法测量，因此改为N=KGa（P—P*）=KLa（C*—CL）N=KLa（C*—CL)五、影响供氧的因素氧的传递速率N=KLa×（C*-CL